Peroksidaz enziminin afinite kromatografisi ile bitkisel kaynaklardan saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Peroksidaz enziminin inhibitörü olan 4-aminobenzohidrazit molekülü tirozinekenetlendirilerek afinite jeli hazırlandı. Kırmızı lahana (Brassica oleracea var. CapitataF. Rubra) bitkisinden peroksidaz (POD) enzimi Sepharose-4B-L-tirozin-4-aminobenzohidrazit afinite kromatografisi kullanılarak tek basamakta %2,9 verimle120,6 kat saflaştırıldı. Enzim aktivitesi spektrofotometrik olarak 470 nm?de ölçüldü.Enzim saflığını kontrol etmek ve molekül kütlesini belirlemek için SDS-poliakrilamidjel elektroforezi yapıldı ve tek bant gözlendi. Molekül kütlesi kırmızı lahana peroksidaziçin yaklaşık 69,3 kDa olarak bulundu. Enzim üzerinde yapılan kinetik çalışmalarneticesinde optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, stabil pH sırasıyla7, 0,1 M, 30°C, 5,5 olarak tespit edildi. Guaiakol substratı için saf enzimlerin KM veVmax değerleri hesaplandı ve kırmızı lahana için KM 0,048 mM ve Vmax 1,46 EÜ/mLolarak belirlendi. Ayrıca saf peroksidaz enzimi üzerine 4-aminobenzohidrazitinhibitörünün inhibisyon etkisi in vitro şartlarda incelendi. 4-aminobenzohidrazitinhibitörü bitki peroksidazı için yarışmasız inhibisyon gösterdiği bulunmuştur vekırmızı lahana için IC50 değeri 1,047 mM olarak Ki değeri ise 0,0702±0,05 mM olaraktespit edildi.

Affinity gel was prepared by coupling tyrosine to 4-aminobenzohydrazide molecule thatis an inhibitor of the peroxidase enzyme. Peroxidase (POD) enzyme of red cabbage(Brassica oleracea var. Capitata F. Rubra) plant was purified in a single step by usingSepharose-4B-L-tyrosine-4-aminobenzohydrazide affinity chromatography with 2,9%yield, 120,6-fold. Enzyme activity was measured spectrophotometrically at 470 nm.SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed to check the enzyme purity andto determine molecular weight and a single band was observed. Molecular masses ofweight of purified enzyme was found to be approximately 69.3 kDa. As a result of thekinetic studies of the enzyme; optimum pH, optimum ionic strength, the optimumtemperature and stable pH were determined as 7, 0.1 M, 30°C, 5,5 respectively for redcabbage. KM and Vmax values were calculated for the purified enzyme using guaiacol assubstrate and for red cabbage. KM and Vmax values were found as 0,048 mM and 1,46EU/mL. Also, inhibitory effect of 4-aminobenzohydrazide inhibitor on purifiedperoxidase enzyme was examined in vitro conditions. 4-aminobenzohydrazide haveshown noncompetitive inhibition for purified peroxidase enzyme of red cabbage, IC50value was calculated as 1,047 mM and Ki value was calculated as 0,0702±0,05 mM.