Candida albicans suşunun fare modelinde kan ve çeşitli organlarda PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) ile gösterilmesi

Abstract

2.6. ÖZETAmaç: nvazif kandidoz tanısında, direkt mikroskopik inceleme ve kültürhalen ?altın standart? yöntemlerdir. Ancak bu hastalarda erken tanı çok önemliolduğu halde kültürün sonuçlanması en az 2 gün sürmektedir. Bu nedenle buçalışmada çok daha kısa zamanda sonuç verebilen PCR yönteminin invazif kandidoztanısında kullanılabilirliği ve duyarlılığı fare modelinde kültür ile karşılaştırılarakaraştırılmıştır.Gereç ve yöntem: Nötropeniye sokulan 21 adet spesifik-patojeniçermeyen 11-13 haftalık dişi BALB/c ırkı fareye 200 L 5x104 C.albicans hücresiverilerek infekte edildi. Her bir zaman noktasında 4 fare olmak üzere (bir tanesinegatif kontrol), fareler 1., 6., 24., 48., 72., 96. ve 144. saatlerde öldürüldü. Her birkan örneğinden 100 L direkt olarak Sabouraud dektroz agara (SDA) ekildi ve37 ºC'de 5 gün inkübe edildi. Geri kalanı DNA ekstraksiyonunda kullanıldı. Ayrıca oher bir farenin akciğer, karaciğer, böbrek ve dalak dokuları da çıkarılıp 1 mL PBSiçinde homojenize edildikten sonra koloni sayımı için homojenatın 100 L'siSDA'ya ekildi. Geri kalanı DNA ekstraksiyonunda kullanıldı.PCR yönteminde, kan ve dokulardaki Candida hücrelerinin DNA'sıHeliosis® (Metis Biyoteknoloji Ltd. Türkiye) ekstraksiyon kiti ile ekstrakte edildi.ITS1, 5.8S rRNA geni ve ITS2'den oluşan fungal ITS bölgesi, ITS 1 ve ITS 4üniversal primerleri kullanılarak amplifiye edildiBulgular: Farelerden alınan 21 kan örneğinin 4'ünde (%19.0), karaciğerörneklerinin 18'sinde (%85.7), dalak örneklerinin 17'sinde (%80.9), böbrekörneklerinin 19'unda (%90.4), akciğer örneklerinin 18'inde (%85.7) kültürlerindeüreme saptandı. En yüksek CFU değerleri böbrekten elde edildi. Toplam olaraküreme olan 75 örneğin 47'si PCR ile pozitif bulunmuştur. En az bir veya daha fazlavisseral organından C.albicans izole edilen, kan kültürü negatif 17 farenin 4'ündePCR yöntemi ile pozitiflik saptanmıştır. Kültür ile karşılaştırıldığında PCRyönteminin duyarlılığı %64.0, özgüllüğü %86.2, pozitif prediktif değeri %92.3 venegatif prediktif değeri % 48.1 olarak bulundu.Sonuç: PCR yönteminin kültüre göre çok daha hızlı sonuç vermesi veözgül olması nedeniyle fungal infeksiyonların tanısında kültür ile birliktekullanılabilecek bir yöntem olduğu sonucuna varılmıştırAnahtar kelimeler: Candida albicans, Sistemik kandidiyazis, PCR,Nötropenik fare modeli.

2.7. ABSTRACTAim: In the diagnosis of invazive candidiasis direct microscopy andculture are still the ?gold standart? methods. Though the early diagnosis is veryimportant for these patients, the resulting of the culture takes at least two days. Forthis reason, we investigated the usability and sensitivity of the PCR methodology,which results much earlier, in the diagnosis of systemic candidiasis in comparisionwith culture in mouse model in this study.21 specific-pathogen-free 11-13 week old,Materials and methods:female BALB/c induced neutropenia mice were infected by inoculation of 200 L of.5x104 CFU of C. albicans per mL in the tail vein. The animals were sacrificed at 1.,6., 24., 48., 72., 96. and 144 h after inoculation using four mice ( one of themnegative control) for each time point. Of each blood sample, 100 L was directlycultured on Sabouraud dextrose agar (SDA) plates and incubated for 5 days at 37 ºC.Another blood samples was used for DNA extraction. In addition whole lungs, liver,spleen and kidneys were homogenized in one mL of PBS and 100 L of homogenatewas cultured on SDA plates to determine the clony forming units (CFU). Other tissuesamples was used for the DNA extraction.For PCR method, DNA from Candida cells present in blood and tissuesamples was extracted by using Heliosis® (Metis Biyotechnology Ltd. Türkiye)extraction kit. The fungal ITS region, comprising ITS1, the 5.8S rRNA gene andITS2 was amplified with universal primers ITS1 and ITS4.Results: Of the 21 blood samples of mice analyzed by culture only 4 werepositive (%19.0). C.albicans were isolated from the liver of 18 mice (%85.7), spleenof 17 mice (%80.9), kidneys of 19 mice (%90.4) and lung of 18 (%85.7) mice byculture. The highest CFU counts were obtained from kidney. In total, of the 75culture-positive samples, 47 samples were positive by PCR method. Of interest wasthe observation that 4 of the 17 blood culture-negative mice who had C.albicansisolated from one or more visceral organs, yielded positive PCR results with bloodspecimens. Compare with the culture, the sensitivity, specificity, positive andnegative predictive value of PCR methods were % 64.0, %86.2, %92.3 and %48.07respectively.Conclusion: It is concluded that, because of higher specificity and givingmore rapid results than culture, PCR method is a diagnostic tool along with culture inthe diagnosis of fungal infections.Key words: Candida albicans, Systemic candidiasis, PCR, Neutropenicmice model