İnsan Paraoksonaz 1 (pon1) geninin klonlanması, Pichia pastoris`te ekspresyonu, Rekombinant enzimin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada metanolle indüklenen AOX (alkol oksidaz) promotörünün kontrolü altında Pichia pastoris ekspresyon sistemi kullanılarak insan paraoksonaz1(PON1) enziminin ekstrasellüler üretimi hedeflenmiş, böylece mikroorganizmanın üreme ortamına salgıladığı protein, hücreyi parçalamaya gerek kalmadan ortamdan saflaştırılabilmiştir. Bu amaçla insan PON1 geni pPICZαA ekspresyon vektörüne klonlanmış, elde edilen rekombinant vektör P. pastoris X-33 genomuna entegre edilmiştir. Böylelikle ekstrasellüler PON1 enzimi güçlü AOX promotörünün kontrolü altında eksprese edilmiş, Saccharomyces cerevisiae alfa faktör sinyal sekansı aracılığıyla enzimin fermentasyon ortamına salgılanması sağlanmıştır. Katı besiyerinde 48-72 saat geliştirilen rekombinant hücreler, gliserol içeren ön kültür besiyerine inoküle edilmiş, gelişen hücreler santrifüjle ayrıldıktan sonra metanol içeren çalkalamalı erlenmayer üretim besiyerine transfer edilerek 96 saat geliştirilmiştir. PON1 üretimi için karbon kaynağı olarak sorbitol ve AOX promotörünün indükleyicisi olarak her 24 saatte bir metanol ilave edilmiştir. SDS-PAGE ve western blot analizi, rekombinant P. pastoris tarafından üretilen ekstrasellüler PON1 enziminin molekül kütlesinin 59,1 kDa olduğunu göstermiş, ProbondTM afinite kolonu ile saflaştırıldıktan sonra enzimin biyokimyasal karakterizasyonu yapılmıştır. Bu çalışmada PON1 enzimi, ilk kez P. pastoris ekspresyon sisteminde eksprese edilmiştir.

In this study, extracellular production of human paraoxonase 1 (PON1) enzyme under the control of AOX (alcohol oxidase) promoter inducing with methanol by using Pichia pastoris expression system was aimed. So, protein which is secreted to fermentation medium by microorganism was purificated without the need to cell lysis. For this purpose, human PON1 gene was cloned into an expression vector pPICZαA and the recombinant vector was integrated to P. pastoris X-33 genome. In this way, extracellular PON1 enzyme was expressed under the control of the strong AOX promoter and the secretion of the enzyme in the fermentation medium was achieved by means of Saccharomyces cerevisiae alpha factor signal sequence. The recombinant cells grown for 48-72 hours in solid medium were inoculated in glycerol containing precultivation medium. After being separated by centrifugation, cells were grown for 96 hours by transferring into the methanol containing shake flask production medium. In order to produce PON1, sorbitol as a carbon source and methanol as an inducer of AOX promoter were added to the medium in every 24 hours. SDS-PAGE and western blot analyses illustrated that the molecular mass of extracellular PON1 enzyme produced by the recombinant P. pastoris strain was 59,1 kDa and after the enzyme purification with ProbondTM affinity column, biochemical characterization was done. This was the first time PON1 is expressed in P. pastoris expression system.