İnsan karaciğeri pon1 enzim geninin klonlanması, inklüzyon cisimciklerinden arındırılarak protein yapısının yeniden katlandırılması ve enzimin karekterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada PON1 enzimi, insan karaciğer dokusundan rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak Escherichia coli (BL21DE3) hücresinde üretildi. SUMO-hPON1 enzimi nikel-nitrilotriasetik asit afinite kromatografisi kullanılarak doğal şartlarda %93,5 verim ve 226,88 EU/mg spesifik aktivite ile 17,12 kat saflaştırma katsayısıyla saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlesini tespit etmek amacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı ve tek bant elde edildi. SUMO-hPON1 enziminin kütlesi 51,52 kDa olarak belirlendi. İnklüzyon cisimciklerinin saflaştırılması, refolding işlemi gerçekleştirildi. Enzim %92,72 verim ve 215,93 EU/mg spesifik aktivite ile 12,31 kat saflaştırma katsayısı ile saflaştırıldı. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı. SUMO-hPON1 enziminin kütlesi 53,48 kDa olarak belirlendi. Ayrıca saflaştırılan hPON1 enziminin karakterizasyonu yapılarak enzimin optimum iyonik şiddet, optimum pH, optimum sıcaklık, Km ve Vmax değerleri belirlendi.

In this study, PON1 enzyme was produced from human liver tissue by using recombinant DNA technology in Escherichia coli (BL21DE3) cell. SUMO-hPON1 was purified in nature conditions with 226.88 EU/mg of specific activity 93.5% of purification yield and 17.12 of purification folds by using Nickel-nitrilotriacetic acid affinity chromatography. To check the purity and determine the molecular mass of the purified enzyme SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed and a single band was observed. Molecular mass of SUMO-hPON1 enzyme was determined as 51.52 kDa. Inclusion body solubilization and refolding were done and enzyme was purified with 215.93 EU/mg of specific activity 92.72% of purification yield and 12.31 of purification folds. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed. Molecular mass of SUMO-hPON1 enzyme was determined as 53.48 kDa. In addition, for characterization of purified hPON1 enzyme optimum ionic strength, optimum pH, optimum temperature, Km and Vmax values were determined.