Gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) karaciğer dokusundan mitokondriyal tiyoredoksin redüktaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerine in vitro etkilerinin incelenmesi

Abstract

Tiyoredoksin redüktaz (E.C 1.6.4.5. ; TrxR) enzimi piridin nükleotid-disülfid oksidoredüktazların flavoprotein ailesine bağlı bir enzimdir. Bu tez kapsamında mitokondriyal TrxR enzimi gökkuşağı alabalığı karaciğerinden saflaştırıldı. Saflaştırma işlemi; homojenatın hazırlanması ve 2',5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi olmak üzere 2 aşamada gerçekleştirildi. Enzim 11,9 EÜ/mg protein spesifik aktiviteyle, %2,38 verimle ve 672 kat saflaştırıldı. Enzimin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edilerek alt biriminin molekül kütlesi yaklaşık 70 kDa olarak hesaplandı. Enzim için optimum pH fosfat tamponunda pH: 7,5; stabil pH, fosfat tamponunda pH: 8,0; optimum sıcaklık 0°C ve optimum iyonik şiddet 0,5 M fosfat tamponunda pH: 7,5 olarak belirlendi. Enzimin doğal molekül kütlesi jel filtrasyon kromatografisi metoduyla 151 kDa olarak bulundu. Ayrıca NADPH substratı için KM sabiti 12,65 µM ve Vmax değeri 0,51 EÜ/ml; DTNB substratı için KM sabiti 0,83 µM ve Vmax değeri 0,079 EÜ/ml olarak belirlendi. Gökkuşağı alabalığı karaciğerinden saflaştırılan mitokondriyal TrxR enzim aktivitesi üzerine Se+4, Cu+2, Co+2, Ni+2, Fe+3 ve Al+3 metal iyonlarının inhibisyon etkisi in vitro olarak araştırıldı. Se+4 iyonu enzim aktivitesini arttırırken metal iyonlarının tamamı inhibisyon etkisi gösterdi. İnhibisyon etkisi gösteren diğer metal iyonlarının Lineweaver-Burk grafikleri yardımıyla Ki sabitleri ve inhibisyon türleri belirlendi. Ki sabitleri sırayla Al+3 için 0,14±0,026 mM, Co+2 için 0,17±0,033 mM, Fe+3 için 0,34±0,025 mM, Cu+2 için 0,85±0,045 mM ve Ni+2 için 1,60±0,285 mM olarak hesaplandı. Ayrıca DTNB için özgüllük sabiti (V0) 44×103 dk-1 µM-1 ve turnover sayısı (kcat ) değeri 36,2×103 dk-1 olarak bulundu.

Thioredoxin reductase (E.C 1.6.4.5.; TrxR) is an enzyme belonging to flavoprotein family of pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductases. In this thesis, mitochondrial TrxR enzyme was purified from rainbow trout liver. The purification of the enzyme was performed by two steps procedure as preparation of homogenate and 2',5'-ADP Sepharose 4B affinity chromatography. Enzyme was obtained having a spesific activity of 11.9 EU/ml proteins with a yield of 2,38% and 672 of purification fold. The purity of the enzyme was controlled and molecular weight of its subunits were calculated as 70 kDa by SDS-PAGE. Optimal pH, optimal ionic strenght, optimal temperature, stable pH for enzyme were determined as pH 7.5 at 500 mM phosphate buffer, 0°C and pH 8.0 at phosphate buffer, respectively. The native moleculer mass of the enzyme was found to be approximately 151 kDa by gel filtration chromatography. Besides, KM constants and Vmax values for both substrates, DTNB and NADPH, were calculated as 0.828 µM and 0.079 EU/ml and 12.65 µM and 0.513 EU/ml. Respectively in vitro effects of Al3+, Co2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+ and Se4+ metal ions on the enzyme activity were examined. Ki constants for metal ions inhibiting enzyme were determined as 0.14±0.026 mM, 0.17±0.033mM, 0.34±0.025mM, 0.85±0.045mM and 1.60±0.285 mM. V0 values and turnover number (Kcat) for DTNB were calculated as 44×103 min-1 µM-1 and 36.2× 103 min-1