İnsan serum bütirilkolinesterazının karaciğer HepG2 hücrelerinde lipid metabolizması ile etkileşiminin incelenmesi

Abstract

Gök, M. İnsan serum bütirilkolinesterazının karaciğer HepG2 hücrelerinde lipid metabolizması ile etkileşiminin incelenmesi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyokimya Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2015. Karaciğerde sentezlenen bütirilkolinesteraz (BChE), çoğunlukla ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu ile ilişkilendirilir. Daha önce sedanter erkek öğrenciler ile yaptığımız çalışmada, egzersiz ve/veya konjuge linoleik asit (CLA) uygulaması ile BChE ve serbest yağ asit (FFA) seviyelerinin değiştiğini gösterdik. Bu çalışmada linoleik asit (LA) ve α-linolenik asit (ALA)'i HepG2 hücrelerine uygulayarak, bu lipidlerin BChE ekspresyonuna etkilerini gözlemleyip lipid metabolizmasıyla BChE'nin ilişkisini inceledik. Deney grubumuz, BChE ekspresyonunu ve LA ile ALA uygulamalarının hücre döngüsündeki etkilerini incelediğimiz normal HepG2 hücrelerinden oluşmaktadır. HepG2 hücreleri Reverse transkriptaz PCR (RT-PCR) analizinde herhangi bir BChE ekspresyonu göstermedi. Bu yüzden doğal tip insan BChE plazmidi çoğaltılıp HepG2 hücrelerine transfeksiyonu yapıldı. Akım sitometrisi ile analiz edilen BChE transfeksiyonu yapılmamış HepG2 hücrelerinde LA ve ALA'nın yüksek konsantrasyonda (sırasıyla 500 μM ve 50 μM) uygulaması HepG2 hücreleri üzerinde toksik etki gösterdi. ALA'ya göre daha toksik etki gösteren LA, HepG2 hücrelerinin tutunmasını engelledi. WST-1 yöntemi ile LA için IC50 değeri 149.3 μM olarak bulundu ve çalışma için uygun ALA ve LA konsantrasyonları 5 μM olarak belirlendi. RT-PCR ve aktivite sonuçlarında gözlemlediğimiz üzere, BChE plazmidinin HepG2 hücrelerine transfeksiyonu BChE ifadesinde artışla sonuçlandı. BChE'nin HepG2 hücrelerine transfeksiyonu sonrası ALA'nın 5 μM uygulaması, hem transfeksiyon işlemi yapılan hem de transfeksiyon işlemi yapılmayan hücrelere göre BChE ifadesinde artışa neden oldu. Bu BChE ifadesindeki artış, LA uygulamasıyla gözlenen toksik etkiyi azalttı ve hücre sayısında artışa neden oldu ancak hayalet hücre görünümünü sürdürdü. Diğer yandan ALA uygulaması hem BChE plazmidi transfeksiyonu yapılan hem de herhangi bir transfeksiyon işlemi yapılmayan HepG2 hücrelerinde, BChE ifadesinde ve BChE aktivitesinde belirgin bir artışa neden oldu. Sonuçlarımız BChE ile lipid birikiminin ve hücre çoğalmasını arttığını gösterdi. Elde ettiğimiz bulgular BChE'nin lipid metabolizması ile ilişkili olduğunu göstermektedir.Anahtar kelimeler: Bütirilkolinesteraz, HepG2, Linoleik asit, α-Linolenik asit, ekspresyon analizleri.

Gök, M. Hacettepe University Institute of Health Sciences, Biochemistry Program, MSc Thesis, Ankara, 2015. Interactıon of human serum butyrylcholinesterase with lipid metabolism of liver HepG2 cells. Butyrylcholinesterase (BChE) synthesized in liver is mostly associated with the detoxification of xenobiotics. Recently we have shown that in sedentary young males, application of exercise and/or conjugated linoleic acid (CLA) changes both free fatty acids(FFA) and BChE levels. In this study to analyze the involvement of BChE in lipid metabolism, we have applied linoleic acid (LA) and α-linolenic acid (ALA) to HepG2 cells to observe the effects of these lipids on BChE expression. Our experimental group consisted of normal HepG2 cells, in which we analyzed the expression of BChE and the effects of these treatments on cell cycle. HepG2 cells did not display any BChE expression as analyzed by Reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Hence wild type human BChE plasmid was amplified and transfected to HepG2 cells. Application of high concentrations of linoleic (500 μM) (LA) and linolenic acid (50 μM) (ALA) to HepG2 cells without BChE transfection caused toxicity as analyzed by flow cytometry. LA was observed to be more toxic than ALA, leading to unattached cells. The IC50 value of LA was found as 149.3 μM and the appropriate LA and ALA concentrations were determined as 5 μM by WST-1 assay. Transfection of BChE plasmid to HepG2 cells yielded increased BChE expression as observed by RT-PCR and activity assays. Application of 5 μM ALA after BChE transfection to HepG2 cells resulted in increased expression of BChE as opposed to both untransfected and transfected cells. The toxicity observed during LA treatment was diminished and cell proliferation increased, although the cells retained a ghost cell like property. Application of ALA on the other led to an overall increase in both cell numbers and BChE expression and activity. Our results indicate that BChE transfections help HepG2 cells to internalize more lipids and lead the cells to a more proliferative state. Hence, the interaction of butyrylcholinesterase with lipid metabolism is much closer than realized before. Keywords: Butyrylcholinesterase, HepG2, Linoleic acid, α-Linolenic acid, expression analyses.