Isolation and purification of M3A-DNA glycosylase from human placenta and its mechanism of action on methylated DNA treated with (3H) dimethylsulfate

Abstract

-128- ÖZET Prokaryotlarda bugün var olan (constitutive) veya uyarılabilen (inducible) DNA onarım enzimleri ve bu enzimleri kodlayan genler iyice araştı rılmıştır. Buna rağmen, ökaryotik DNA onarım mekanizmaları hakkındaki bilgi lerimiz hala başlangıtçadır ve bu sahada daha bir sürü bilinmeyen konular bu lunmaktadır. Bu sahadaki çalışmaların yavaş olmalarına sebep normal Ökaryotik hücrelerden mutant tiplerin elde edilmesindeki güçlüktür. Sadece, bir basit ökaryot olan mayada başarı kaydedilmiştir. Okaryotlardaki DNA onarım mekaniz malarının önemi, son zamanlardaki çalışmalarla desteklenen kalıtsal hastalıklar ile DNA onarım mekanizmaları eksiklikleri arasındaki ilişkilerden dolayı giderek artmaktadır. Son yıllarda birçok araştırıcı, hücrelerdeki fizyolojik ve biyo kimyasal olaylarla DNA onarımı arasında var olabilecek ilişkileri bulmak için çalışmaktadır. Zamanımızda viral ve kimyasal karsinojenesisi hücre genetiği çatısı altında toplama çalışmaları bizi, başlangıç (initiation) fazında mutasyona ve daha sonra da ilerleme (promotion) fazında kansere götüren veya normal hücre genlerinin fazla aktif olmalarını sağlayarak kansere neden olan tnarsposed (yer değiştirmiş), uygun olmayan (inappropriate), ve bozuk. (damaged) genlerin fonksiyon larını araştırmaya şevke tmektedir. Böyle normal/ anormal genlerin fonksiyonlarının okunmalarının ve kontrol mekanizmalarının (araştırıcıların kanser problemini çöz mekte güttükleri yaklaşımları ne olursa olsun) anlaşılması çok önem taşımaktadır. Kanser hastalığının bu yönünü göz önünde tutarak ve aynı zamanda memeli hücrelerindeki DNA onarım mekanizmalarını kavramak ve bu konuyu daha da derinleştirmek üzere hali hazırda yapılmakta olan çalışmaların bir parçası olarak bu çalışmaya başladık. Bu amaçla> geleneksel saflaştırma yöntemlerini kullanarak insan plasentasından 3 metil adenin DNA glaykosilaz enzimini ayırıp, saflaştır- dık. Plasentanın seçimi insan organlarındaki farklı enzimlerin araştırılması programının bir parçasını oluşturması içindi. Plasenta, her ne kadar bir artık organ olarak düşünülürse de fetus için temel ve hayati önem tayışan fonksiyonları yürütmektedir. DNA'y1 zedelemek (bozmak) için, DNA'yı fazla miktarda metilleyen, 3 ( H) dimetilsülfat kullanıldı. Ayrıca, metillenme ve karsinogenesis arasındaki ilişkiyi de (hatırda tutmaktaydık) biliyorduk. Dimetil sülfat zayıf korsinoj en ler sınıfında gösterilmekteyse de sıçanlara deri altı injeks iyonu ile verildiğinde lokal sarkomalar (tümörler)a neden olmaktadır. Metillenmenin dana timus DNA'smda adeninin 3. azotunda oluşu iyon değişim ve kağıt kromatograf ileri ile gösterildi. Enzim % 70 lik amonyum sülfat. DEAE-selüloz, fosfo selüloz ve DNA af finite.129- kromatograf isi kullanılarak 98 kere saf laştırıldı Enzim horaojenitesi de poliakrilamid jel elektroforezi ile gösterildi. Her ne kadar bu enzimin fizik-.. 3 sel özellikleri olanaksızlıklar nedeniyle çalışılamadıysa da enzimin ( H) dime- til sülfat ile muamele edilmiş DNA üzerindeki etki mekanizması etraflıca araş tırıldı. Çalışmalar, bu enzimin adenin 9. azotu ile deoksiribozun 1. karbonu arasındaki glaykosilik bağı kırarak, 3-metil adenini serbest hale getirdiğini gösterdi. Serbest hale geçen 3-metil adeninin tanımı ise radyoaktivite sayımı ve her saflaştırma metodunu takiben gerçek standard işaret (marker) 1er kulla nılarak Whatmamn 3MM kağıtları ile yapılan kağıt kromatograf isi yardımı ile yapıldı. Bu enzimin insan plasentasından başarılı bir şekilde izole edile rek saflaştırılması, Friedberg tarafından açıklandığı gibi onun her yerde bulun ması tabiatının anlaşılmasına doğru atılmış bir ileri adımdı. Bu enzimin pla sentada bulunması onun görevi (fonksiyonu) hakkında bir sorunun atılmasına neden olmaktadır. Acaba, bu DNA da kendiliğinden olan değişmeler ve metillenmelerin varlığına mı işarettir? I am cordially thankful to Dr. Hasan Bağcı, Assistant Professor, Department of Biological Sciences, METU, for this translation and Ms Aliye Ertekin for typing this Turkish section

-126- SUMMARY Enzymology of the mechanisms of DNA repair in Prokaryotes which are now known either as constitutive or induced; and the genes responsible for the syntehesis of these enzymes are well studied. However, in the case of Eukaryotes our knowledge about repair mechanisms is under progress and much remains to be solved. The main reason of having less knowledge, is the failure to find mutant cells from normal mammalian cells, although there is some success with a lower Eukaryote 'Yeast'. The importance of DNA repair mechanism in Eukaryotes is well recognised by recent developments in the field which show a direct relationship between some hereditary disorders and deficiency in DNA repair mechanism. Many investigators in recent years have undertaken the job in order to establish a relationshilp between DNA repair and physiological and biochemical events of the cells. Recent attempt to unite both viral and chemical carcinogenesis under the same umbrella of cell genetics also encourage to investigate the function of damaged, inappropriate (one), or transposed genes which leads to mutation during initiation and then tumorigenesis during promotion (stage hypothesis) or leads to increased expression of normal cellular genes causing cancer. The function, expression and control mechanism of such normal/inappropriate genes remains important irrespective of the investigators approach towards cancer problems. Keeping in view these aspects of cancer disease, we have undertaken the present study which is a part of ongoing research to understand and extend the DNA repair mechanism in mammalian cells. For the purpose we have isolated and purified-127- 3 M A DNA glycosylase from human placenta using conventional methods of purification. Placenta was choosen as part of ongoing programme to investigate different enzymes from human organs. Placenta though considered a waste organ performs functions of basic and vital importance for the fetus. In order to damage the DNA 3 molecule, ( H) Dimethylsulf ate was used since it methylates the DNA in a rich ratio. In addition, we are also aware of the importance of relationship -between methylation and carcinogenesis. Dimethyl- sulfate though classified as weak carcinogen, it can induce sarcoma locally after subcutaneous injection in rates. ' Methylation at 3rd N position of adenine in calfthymus DNA was confirmed by paper and ion exchange chromatography. The enzyme was purified to 98 fold using 70% ammonium sulfate, DEAE-cellulose, P-cellulose and DNA affinity chromatography. The homogenous nature of the enzyme was determined by poly-acrylamide gel electrophoresis. Although the physical properties of this enzyme could not be determined due to unavailability of the fascilities, the mechanism of action on 3 methylated DNA treated with ( H) Dimethylsulf ate was well studied. It was found that this enzyme cleaves the glycosylic bond between Ng of adenine and C, of deoxyribose, liberating free 3 -methy ladenine identified by counting the radioactvitity and confirmed by paper chromatography on Whatmann 3MM paper using authentic standard markers, after each step of purification. A successful isolation and purification of this enzyme from human placenta is a further step towards its ubiquitos nature as described by Friedberg. Its existance in the placenta raises the question about its role. Does it mean that there are spontaneous alterations/methylation in the DNA?