Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz eksikliğinin moleküler patolojisinin DNA dizi analizi ile saptanması

Abstract

Kalıtsal Glukoz-6-fosfat dehîdrogenaz (GePD; EC 1.1.1.49) eksikliği en yaygın eritrosit enzim bozukluklanndan biridir ve dünyada 400 milyondan fazla insanı etkilemektedir. GePD enzimi pentoz fosfat metabolik yolunun ilk basamağını katalizleyen ve kontrol noktasını oluşturan enzimdir. Bu enzimin ana görevi özellikle eritrositlerde indirgenmiş halde glutatyon sağlamak için gerekli olan antioksidan NADPH üretmektir. GePD geni insanda X kromozomu üzerinde yerleşim gösteren (Xq28) 13 ekson ve 12 introndan oluşur. Çok sayıda varyantının bulunması sıklıkla karşılaşılan genetik bozukluklara yol açmaktadır. Varyantlann her biri çeşitli şiddetlerdeki enzim eksikliğine neden olmaktadır. Gende meydana gelen mutasyonlar sonucunda hücrelerde NADPH eksikliği baş göstermektedir. Bu durum NADPH bağımlı glutatyon redüktaz enziminin görevini yapmasını engelleyerek hücrelerde iç ve dış kaynaklı oksidan maddelerin birikimine neden olmaktadır. Böyle bireylerde GePD eksikliğinin en önemli belirtisi olan hemolitik anemi görülmektedir. Hemoliz; ilaç kullanımı, bakla yenmesi, enfeksiyon gibi çok çeşitli nedenlerden kaynaklanabilir. G6PD eksikliği ile ilgili çalışmalar 19501i yıllarda enzim düzeyinde başlamıştır. Son yıllarda ise enzimi etkileyen mutasyonlar DNA düzeyinde araştırılmaya başlanmıştır. Günümüzde GePD genindeki mutasyonlan araştırmak için PCR, Restriksiyon Fragment Uzunluk Polîmorfizmi (RFLP) Analizi, DNA Dizi Analizi gibi yöntemler kullanılmaktadır.Sunulan bu çalışmada G6PD genindeki mutasyonların saptanması için DNA dizi analizi yöntemi uygulanmıştır. G6PD eksikliğine neden olan mutasyonlan PCR'a dayalı enzim kesimi ile saptamak mümkündür. Ancak 13 tane eksonu olan GePD geninde, pek çok mutasyonun saptanabilmesi için DNA dizi analizi yapılması gerekmektedir. Laboratuvanmızda 59 aileden 98 birey üzerinde çalışılmış ve enzim kesimi ile 79 bireyde Akdeniz mutasyonu bulunmuş ve 5 bireyin de A+ olduğu saptanmıştır. Enzim kesimi ile mutasyonu bulunamayan bireyler bu tez çalışmasının konusunu oluşturmuştur. Dizi analizi tekniğinin oturtulabilmesi ign ilk olarak mutasyonu bilinen bireylere ait DNA'larla, DNA dizi analizine başlanmıştır. Ekson 6'da bulunan Akdeniz tipi 563 C-»T mutasyonu, ekson 5'te bulunan polimorfik 376 A-»G dönüşümü DNA dizi analizi ile gösterilmiştir. Daha sonra mutasyonu bulunamayan 14 bireyin dizi analizleri mutasyonlann en yoğun olduğu eksonlardan başlanarak yapılmıştır. Ekson 5te bulunan polimorfik 376 A-»G dönüşümü ile link olduğu düşünülen ekson 4'te bulunan 202 G-»A mutasyonu dizi analizi ile gösterilmiştir. Ayrıca iki hastada ekson 9'da bulunan Chatam 1003 G-»A mutasyonu da DNA dizi analizi İle gösterilmiştir.

Hereditary Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD; EC 1.1.1.49) deficiency is one of the most common erythrocyte enzyme defects with more than 400 millions of people affected worldwide. GöPD is the enzyme which catalyzes the first step of the pentose phosphate pathway and this step is the control point of that pathway. The main function of GePD, particularly in erythrocytes, is to produce potent antioxidant NADPH which is essential for maintaining glutathion in the reduced form. The gene for G6PD is localized on the X chromosome (Xq28) and it has 13 exons and 12 introns. It has many variants which causes enzyme deficiency with different severity. Due to the mutations in the GePD gene NADPH deficiency is seen in the cells. As a result, NADPH dependent glutathion reductase enzyme is blocked and oxidant substances accumulate in the cells. Hemolytic anemia, the most important symptom of GöPD deficiency, is seen in the GöPD deficient individuals. Hemolysis is originated from various reasons like ; using drugs, infections or eating fava beans. The studies about GöPD deficiency was started in 1950s in the protein level. But in recent years the mutations that affects the enzyme activity is studied on DNA level. The techniques such as Polymerase Chain Reaction (PCR), Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), DNA Sequence Analysis are being used to detect the mutaions in GöPD gene.In the presented study DNA sequence analysis tecnique Is used in order to detect the mutations that are found in the GePD gene, it is possible to detect the common mutations with PCR based enzyme cleavage of DNA. But GöPD gene is a large gene with 13 exons. So it is necessary to use DNA sequence analysis. In our laboratory 98 individuals from 59 families were studied and in 79 patients Mediterranean type mutation was found and 5 patients were found to be A+ with PCR based RFLP analysis. The 14 patients whose mutations could not be detected by this technique are the subject of this study. In order to optimize DNA Sequence Analysis technique we used the patients whose mutations were known. Mediterranean type 563 C->T mutation and polimorphic 376 A-»G conversion are shown with DNA sequence analysis. The sequence analysis of the 14 patients, whose mutations are not known, was started from the exons in which the mutation frequency is high. The 202 G-»A mutation which is thougt to be linked with polymorphic 376 A-»G conversion is shown with DNA sequence analysis. Also Chatam 1003 G-*A mutation is detected in two of our patients.