Fluorimetric investigation of conjugation reaction between fluorescein isothiocyanate and insulin

Abstract

FLORESCEİN İZOTİYOSİYANAT İLE İNSULİN ARASINDAKİ KONJUGASYON TEPKİMESİNİN FLORİMETRİK İNCELENMESİ Seda Olgaz ÖZ Floresans spektroskopisi biyoanalitik uygulamalarda yaygın olarak kullanıl maktadır. Bu çalışmada floresein izotiyosiyanat amin reaktif floresant uç olarak kullanılmıştır, insulin farmakolojik önemi, fonksiyonu ve çeşitli reaktif gruplara sahip olması nedeniyle florimetrik işaretleme çalışması için model protein olarak seçilmiştir. Çalışmada florofor ve protein arasındaki mol oranının tayini için florimetrik bir yöntem sunulmuştur, insulin çözeltilerinden tyrosin floresansı Xuv/Xem= 276/300 nm'de, FITC çözeltilerinin floresansı A.uy/Xem=494/518 nm dalgaboy- larında ölçülmüştür. Konjugasyon için FITC ve insulin çözelti serileri hazırlanarak, floresans şiddetleri kaydedilmiştir. Değişik formal derişimlerle yapılan florimetrik titrasyonlar intrinsik A,uyA*m=494/518 ve ekstrinsik 276/518 nm'de emisyon şiddetlerinden ve emisyon spektrumlarından incelenmiştir. Tüm sonuçlar, insulinden FITC'a molekül içi bir enerji transferi ile 3 mol FITC/1 mol insulin bağlanma oranının olduğunu göstermiştir. Optimum deneysel şartlar kullanılarak, insulin tayin alt sınırı 2.66 x 10`7 M olarak bulunmuştur. Deneysel çalışmalarımız kapiler elektroforez ve FTIR ile desteklenmeye çalışılmıştır. Ayrıca önerdiğimiz yapıların toplam enerjileri bilgisayar programı Extended Hückel metodu ile hesaplanmıştır. Sonuçlara göre, arjinin(22) ve histidin (5 ve 10) olmak üzere insulinin üç uçtan FITC ile bağlanabildiği bulunmuştur. Anahtar kelimeler: Floresant uç; İşaretleme; Konjugasyon; Mol oranı; insulin Danışman : Doç. Dr. Elmas Gökoğlu, Hacettepe Üniversitesi, Kimya Bölümü, Analitik Kimya Anabilim Dalı.... r^Öİ^^l*'*'

FLUORIMETRIC INVESTIGATION OF CONJUGATION REACTION BETWEEN FLUORESCEIN ISOTHIOCYANATE AND INSULIN Seda Olgaz ABSTRACT Fluorescence spectroscopy is widely used in many bioanalytical applications. In this study, fluorescein isothiocyanate (FITC) was used as amine reactive fluorescent probe. Insulin was chosen as a model protein for fluorimetric labeling study because of its pharmacological importance, function and several reactive groups. A fluorimetric method has been presented for the determination of the fluorophore to the protein (F/P) mol ratio. The tyrosine fluorescence was measured from insulin solutions at wavelengths X^/ /&r/ = 276 / 300 nm and from FITC solutions at Xex / Xem = 494 / 518 nm. Series of solutions prepared from insulin and FITC were tested for conjugation, recording their fluorimetric intensities. Fluorimetric titrations with different molar concentrations were followed either by intrinsic and extrinsic emission intensities at X^l X&n = 494 or 276 / 518 nm and by their typical emission spectra. All results denoted a well defined intramolecular type energy transfer from insulin to FITC-tag with an apparent binding ratio of 3 moles of FITC/1 mol of insulin. Using optimum experimental conditions, quantification limit of insulin was 2.66 x 10`7 M. Our experimental studies were supported by capillary electrophoresis and FTIR. Also total energy of our model compounds were calculated by Extended Hückel method of computational programme. Results showed that insulin could only bind with FITC from three residues; arginine(22) and histidine(5 and 10). Keywords : Fluorescent probe; Labeling; Conjugation; Mol Ratio; Insulin Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Elmas Gökoglu, Hacettepe University, Department of Chemistry, Analytical Chemistry Section.