Bacillus thuringiensis Xd3`e ait cry3Aa geninin klonlanması, karakterizasyonu ve ekspresyonu

Abstract

Bacillus thuringiensis, bazı böcek gruplarına karşı insektisidal özelliğe sahip kristal yapıda toksin üreten bir toprak bakterisidir. Bu özelliğinden dolayı Cry (?-endotoksin) proteinleri biyolojik mücadele açısından büyük önem taşımaktadır.Bu çalışmada bir fındık zararlısı olan Xyleborus dispar'dan izole edilmiş Bacillus thuringiensis bakterisinden (Bt Xd3) elde edilen cry3Aa geninin farklı bir konak olan Escherichia coli'ye klonlanması, karakterize edilmesi, ekspresyonu ve insektisidal aktivite testi gerçekleştirilmiştir.Bunun için cry3Aa geni Bt Xd3 bakterisinden PCR ile çoğaltıldı. Çoğaltılan genin nükleotid dizilimini belirlemek için PCR ürünü pGEM-T Easy klonlama vektörüne klonlandı. cry3Aa geninin DNA ve aminoasit dizilimi belirlendi ve mevcut cry3Aa genleri ile karşılaştırıldı.Bu bakteriye ait Cry3Aa proteininin literatürdeki Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (morrisoni)'in sahip olduğu Cry3Aa2, Cry3Aa3, Cry3Aa5 ve Cry3Aa6 ile %100 benzer olduğu belirlendi. Bt Xd3 cry3Aa gen sırası gen bankasına cry3Aa12 numarası ile geçirildi.cry3Aa geni tarafından üretilen proteini farklı bir konakta ekspres etmek ve aktivitesini belirlemek için gen, ekspresyon vektörü olan pET-28a(+)'ya klonlandı. Ekspresyon vektöründe ekspres edilen protein izole edildi ve proteinin SDS-PAGE analizi yapıldı. Jel üzerinde cry3Aa genine ait 73kDa'luk protein bandı gözlendi.Elde edilen bu Cry3Aa ?-endotoksininin Coleoptera ordosuna ait Alphitobius diaperinus larvalarına karşı olan insektisidal etkileri belirlendi. Yapılan insektisidal aktivite testi sonucunda E.coli BL21(DE3)'de ekspres edilen rekombinant proteinin larvalar üzerinde B. thuringiensis'teki spor-kristal karışımından daha az etkili olduğu tespit edildi.

Bacillus thuringiensis, is a soil bacterium which produce insecticidal crystal toxin against some insect orders. Because of this feature, Cry3Aa (?-endotoksin) proteins have great importance in terms of biological control.In the present study, cloning in a different host Escherichia coli, characterization, expression and bioassay of cry3Aa gene of Bacillus thuringiensis (Bt Xd3) isolated from Xyleborus dispar which is a hazelnut pest were performed.For this reason cry3Aa gene was amplified from Bt Xd3 bacteria by PCR. For identifying the nucleotide sequence of the amplified gene, PCR product was cloned into the pGEM-T Easy cloning vector. Nucleotide sequence of cry3Aa gene and its deduced amino acid sequence were determined and compared with other cry3Aa genes.The Cry3Aa protein belong to B.thuringiensis (Bt Xd3) has %100 homology with Cry3Aa2, Cry3Aa3, Cry3Aa5 and Cry3Aa6 proteins of Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis (morrisoni) in literature. Bt Xd3 cry3Aa gene sequence was recorded in gene bank as cry3Aa12.To express the protein produced by cry3Aa gene in a different host and detect its insecticidal activity the gene was cloned into pET-28a(+) expression vector. The protein expressed in expression vector was isolated and SDS-PAGE analysis of the protein was performed. 73kDa protein band belonged to cry3Aa gene was observed on polyacrylamide gel.Insecticidal activity of this obtained Cry3Aa ?-endotoxin against Alphitobius diaperinus larvae belong to Coleoptera order was determined. As a result of the performed bioassay, recombinant protein expressed in E.coli BL21(DE3) is found as less effective than spor-crystal complex in B. thuringiensis on Coleoptera larvae.