Enterococcus faecium A2`den lakkaz enziminin üçlü faz ayırma sistemi ile saflaştırılması, karakterizasyonu ve biyoteknolojik uygulanabilirliğinin araştırılması

Abstract

Bu tez çalışması kapsamında; Ağrı-Diyadin ilçesinden temin edilen sıcak su örneğinden, toplam 2 adet termotolerant bakteri izole edildi. İzolasyon sonrasında yapılan, konvensiyonel ve moleküler analizler sonucunda 2 izolat A2:Enterococcus faecium; A4:Lysinibacillus macroides tür düzeyinde belirlendi. Sıvı besiyerine alınan bakterilerde lakkaz üretimi denemeleri sonucunda, 2 suşda da lakkaz enzim aktivitesinin pozitif olduğu gözlemlendi, en yüksek aktivite ise A2 izolatında tespit edildi. Enterococcus faecium A2 (GenBank No:MH424896) suşundan lakkaz enziminin saflaştırılması TPP yöntemiyle yapıldı. pH: 6,0'da, 1,0:2,0 (ham enzim çözeltisi:t-bütanol oranı) ve %70 doygun amonyum sülfat kullanılarak uygulanan TPP yöntemi sonucunda enzim, %64,59 verimle 0,95 kat saflaştırıldı. Enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE ile yaklaşık 50,11 kDa olarak hesaplandı. Lakkaz enzimi için optimum pH 8,0 ve optimum sıcaklık 80°C olarak belirlendi. Enzimin 20-90°C sıcaklık aralığında tüm sıcaklık değerlerinde, 1 saatlik inkübasyon süresinin sonunda %90 oranında aktivitesini koruduğu tespit edildi. Yüzey aktif maddelerinin varlığında enzimin yüksek oranda stabil kaldığı, organik çözücüler ve Ag+, Cu2+, Cr2+ metalleri varlığında ise enzimin aktivitesini arttırdığı belirlendi. E. faecium A2 lakkaz enziminin ABTS substratı için Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0,366 mg/mL ve 5,29 μmol.mL-1.dk-1 olarak hesaplandı. Son olarak lakkaz enziminin tekstil boyalarının giderimi üzerine etkisini incelemek için Asit Siyah L, Kongo Kırmızı, Metilen Mavisi, Turuncu, Asit Kırmızı 27, Asit Siyah 5 boyaları kullanıldı. Yapılan incelemeler sonucunda en yüksek boya gideriminin Asit Kırmızı 27 boyası üzerinde %40 oranında olduğu tespit edildi.

In this thesis work, a total of 2 thermotolerant bacteria were isolated from the hot water sample obtained from Ağrı-Diyadin springs. 2 isolates were identified as follows using conventional and molecular analysis; A2:Enterococcus faecium; A4:Lysinibacillus macroides. Two strains were observed to be positive in terms of laccase activity and A2 had the highest activity. Purification of laccase enzyme from strain E. faecium A2 (GenBank No: MH424896) was carried out by the TPP method. Enzyme was 0.95 fold purified with 64.59% yield by the method of TPP obtained by using 70% saturated ammonium sulphate and crude enzyme solution: t-butanol in 1.0:2.0 ratio at pH 6.0. The molecular weight of of the enzyme was calculated as about 50.11 kDa by SDS-PAGE. The optimum pH and temperature for laccase enzyme was 8.0 and 80°C respectively. It has been found that the enzyme maintains 90% activity at the temperature range of 20-90 °C at the end of the 1 hour incubation period at all temperature values. The results showed that enzyme activity was stabilized at high levels in the presence of surfactants; and the enzyme activity was increased in the presence of organic solvents and Ag+, Cu2+, Cr2+ metals. The Km and Vmax values for ABTS substrate of the E. faecium A2 laccase enzyme were calculated to be 0.366 mg / mL and 5.29 μmol.mL-1 min-1, respectively. Finally, Acid Black L, Congo Red, Methylene Blue, Orange, Acid Red 27, Acid Black 5 dyes were used to examine the effect of laccase enzyme on the removal of textile dyes. As a result of the investigations, it was determined that the highest color removal rate was 40% on Acid Red 27.