Chilo iridescent virüs`e ait ekzonükleaz geninin (012l) moleküler ve fonksiyonel analizi

Abstract

Chilo iridesent virüs (CIV) Iridoviridae familyasına ait bir böcek virüsü olup, zararlı böcekler arasında geniş konak spektrumuna sahiptir. CIV'nin moleküler biyolojisi hakkında literatürde kısıtlı bilgi bulunmaktadır. Bu eksikliğin giderilmesine katkıda bulunmak amacıyla bu çalışmada biyoinformatik analizlere göre ekzonükleaz fonksiyonuna sahip bir gen olarak gösterilen CIV'ye ait 012L açık okuma zincirinin (ORF) transkripsiyonel ve fonksiyonel analizi gerçekleştirilmiştir. DNA ve protein sentez inhibitörleri varlığında ve yokluğunda gerçekleştirilen enfeksiyonlar, 012L geninin `en erken` grubu gen olarak ifade edildiğini gösterdi. Gene ait zamana bağlı transkripsiyon profili ise transkripsiyonun, enfeksiyondan sonra 0. ve 1. saatler arasında başladığını ortaya koydu. Genin translasyona uğramayan 5' yukarı bölgesinin, translasyon başlangıç noktasına göre -30. nükleotidde başladığı belirlendi. Ayrıca ikili lusiferaz deneyleri ile gerçekleştirilen promotor analizleri, genin muhtemel promotor bölgesinin translasyon başlangıç noktasının yukarısındaki -20. ile -10. nükleotidler arasında olduğunu gösterdi. Fonksiyonel analiz kapsamında ise, 012L proteininin aktivitesi in vitro sistemde araştırıldı. 3' ucu biyotin işaretli oligonükleotitlerin ve lineer çift zincir DNA'nın substrat olarak kullanıldığı çalışmalarda, CIV 012L proteininin 5'-3' ekzonükleaz aktivitesine sahip olduğu tespit edildi. Ayrıca CIV 012L proteininin, süper sarmal plazmit DNA'sını dairesel yapıya, dairesel yapıyı da lineer yapıya dönüştüren güçlü bir endonükleaz aktivitesine sahip olduğu belirlendi.

Chilo iridescent virus (CIV), an insect virus belongs to the Iridoviridae family, is highly pathogenic on important pest insects. Unfortunately, information about the molecular aspects of CIV is not enough so far. Therefore, currently, we determined the transcriptional pattern, promotor region and function of CIV 012L gene. It was determined that the CIV 012L ORF has exonuclease activity according to bioinformatics analysis. The structure and transcriptional regulation of the CIV 012L gene is investigated in this study. Infection of cells in the presence or absence of Ara-C or cycloheximide showed that CIV 012L is transcribed as an immediate-early gene. Time course transcription of the gene showed that the transcription starts between 0 h p.i. and 1 h p.i. after infection. 5' RACE analysis showed that the transcription initiation site is located at 30 nucleotides upstream of the translational start codon. In a Dual luciferase reporter assay, It is clearly shown that sequences between −20 and −10 relative to the transcription start site have key promoter activity for CIV 012L gene. To test whether CIV exonuclease protein is active, functional analysis was done. Therefore, the activity of CIV exonuclease protein was analyzed in vitro. CIV 012L protein confirmed that this viral protein is a functional 5'-3' exonuclease that digests 3'-biotin-labelled oligonucleotides and linear double-stranded DNA molecules from their 5'-termini in a highly processive manner. It was determined that CIV 012L protein has also a potent endonuclease activity in vitro and converted supercoiled plasmid DNA into the open circular form and then open circular form into linear form.