Damlatma ile yeni DPPH ve FRAP antioksidan tayin yöntemlerinin geliştirilmesi ve uygulanması

Abstract

Antioksidan özelliğe sahip standartların aktivite derecelerinin belirlenmesinde ve bitki ekstraktlarının antioksidan içeriklerinin tespitinde kullanılan antioksidan aktivite ölçüm yöntemleri arasında ortamda radikal içerenlerden DPPH radikal temizleme aktivitesi tayini ve radikal içermeyenlerden demir (III) indirgeme/ antioksidan güç (FRAP) tayini en yaygın kullanılan yöntemlerdir. Literatürde ve laboratuarımızda yapılan münferit çalışmalarda bu iki yöntemin kullanıldığı spektrofotometrik çalışmalar mevcuttur. Bu iki yöntemin yaygın olarak kulanılmasına karşın her ikisinin olumsuz yönü bir spektrofotometre cihazına ihtiyaç duyulmasıdır. Yapılan çalışmanın amacı bu iki antioksidan testte de spektrofotometre kullanmadan maliyeti daha düşük ve uygulanabilirliği daha kolay olan yeni bir metod geliştirmektir. Çalışmada bazı antioksidan standartlar ve bitki ekstraktları ile hem spektrofotometrik hem de damlatma yöntemi uygulanılarak DPPH ve FRAP testleri yapılmıştır. Çalışmada yeni geliştirilen damlatma yöntemi için bir çok optimizasyon çalışması (DPPH radikalinin çalışma konsantrasyonu, damlatma hacmi, reaksiyonun gerçekleşme ortamı, farklı özellikteki İTK'ların reaksiyona etkisi gibi) yapılmış, ayrıca her iki testte standartların ve bazı bitki ekstraktlarının reaksiyon kinetikleri belirlenmiştir. İki yöntem kullanılarak çalışılan standart ve bitki ekstraktlarının DPPH ve FRAP testindeki antioksidan aktiviteleri uyum göstermiştir. Dolayısıyla bu durum spektrofotometre olmadan bu antioksidan testlerin yapılabileceğini göstermiştir. Spektrofotometre kullanmadan bir İTK tabaka ve ücretsiz olarak elde edilebilen renk ölçüm programı Image J kullanılarak antioksidan test yapılabilmektedir. Bunların yanında bir başka yeni geliştirilen yöntem olarak yazıcı yardımıyla püskürtme çalışması yapılmıştır. Püskürtme çalışması iki standart ile yapılmış ve diğer spektrofotometrik ve damlatma yöntemleriyle karşılaştırılmıştır. Geliştirilen damlatarak uygulanan spektrofotometresiz DPPH ve FRAP antioksidan tayin yöntemleri hem saf maddelerin hem de gıda ve tıbbi bitki özütleri gibi karışımların aktivitelerinin belirlenmesinde güvenle kullanılabilecektir.

Among the antioxidant activity measurement assays used to determine the antioxidant capacities of standard antioxidants as well as the antioxidant compositions of plant extracts, DPPH radical scavenging activity test as radical involving assay and ferric (III) reducing / antioxidant power (FRAP) test as non-radical involving assay are the most widely used methods. A lot of studies in our laboratory and many investigations in the literature contain spectrophotometric analyses with these two test methods. Although these methods are widely used in antioxidant research, both have the drawback of the need for a pectrophotometer. The purpose of this work is to develop a method of application for both antioxidant assays without using a spectrophotometer and with ease of use. DPPH and FRAP tests were performed for the standard antioxidants and plant extracts using both spectrophotometric and dropping assays in the study. A number of optimizations including working DPPH radical concentration, drop volume, reaction medium, and the effect of İTK plate types were made for the newly developed dropping assay, and the reaction kinetics of the standards and the extracts were investigated in both DPPH and FRAP methods. The antioxidant activities measured with DPPH and FRAP methods showed good correlations between spectrophotometric and dropping assays. The results indicate that these antioxidant methods can applied without needing a spectrophotometer. Thus, antioxidant tests can be performed by using a İTK plate and freely available image processing software Image J. In addition, another new method studied for the first time was investigated by using an ink-jet printer. Ink-jet method was performed for only DPPH assay with two standard antioxidants and compared with spectrophotometric and dropping methods. In conclusion, the newly developed DPPH and FRAP antioxidant determination methods without the use of a spectrophotometer can reliably be used for the determination of the activities of both pure compounds and mixtures as extracts of medicinal plants.