Lactococcus garvieae`nın antijenik proteinlerinin western blot yöntemiyle belirlenmesi

Abstract

Kültür balıkçılığın gelişmesine paralel olarak işletmelerde görülen L. garvieae'nin neden olduğu salgınlar, yetiştiriciliği yapılan türler arasında tehdit oluşturmaktadır. Hastalık, ilk kez Ege Bölgesi ve civarındaki işletmelerde görülmesine rağmen kısa sürede her bölgeye yayılmış ve % 50'nin üzerinde mortaliteye sebep olmuştur. Bu araştırmada Türkiye, İspanya, İtalya ve Fransa'dan izole edilen L. garvieae'nın 43 suşunun, Western Blot tekniğini kullanılarak antijenik protein profillerinin karşılaştırmalı analizlerini yapılmış ve virülans proteinleri belirlenmiştir. Bakterilerin protein profilleri SDS-PAGE ile belirlenmiş, protein izolasyonu yapılmış, protein konsantrasyonu ayarlanmış ve SDS-PAGE elektroforeze yüklenerek yürütülmüştür. Daha sonra protein bantları membrana aktarılmış, blotlama yapılmış ve görüntü alınarak bakterilerin protein profilleri belirlenmiştir. Western Blot yöntemiyle yapılan karşılaştırma sonucunda, 37-50 kDa seviyesi immunodominant bant gözlemlenmiş ve bu bandın virülans proteinleri taşıdığı düşünülmektedir. SDS-PAGE metodunda ise benzerlik oranı düşük bulunan L. garvieae suşları toplam protein analizinde 6 kümede 36 protein tipi oluşturmuştur. Bu da suşlar arasında önemli heterojenitenin olduğunu göstermektedir. İzolatlar arası benzerlik oranlarının düşük olması bu izolatların birbirine uzak alanlardan izole edilmesi ve bakterilerin çevresel ya da kimyasal faktörlerden etkilenerek mutasyon ve benzeri bazı olaylar sonucu genetik yapılarının değişmesinden kaynaklanıyor olabilir.

Infections of fish with Lactococcus garvieae were increased with increasing aquaculture productions and L. garvieae outbreaks have become a threat on farmed species. The disease agent was fist isolated in the Aegean Region and then it has spreeded to every region where rainbow trout cultured in a short time and it caused over 50% mortality. In this study, 43 strains of L. garvieae, isolated from Turkey, Spain, Italy and France were compared with Western Blot technique to determine proteins encoded by virulence gene and to determine total protein profile with SDS-PAGE. Having isolated total protein from bacteria, protein concentration was determined and protein was loaded to SDS-PAGE electrophoresis. After completing electrophoresis, protein bands were transferred to blot and then protein profiles were determined. Having compared Western Blot analysis, immunodominant protein bands between 37 and 50 kDa were observed and assummed that theses bandswere related to virulence gene. Based on SDS-PAGE method, L. garvieae strains formed 36 protein types in 6 clusters with low level of similarity. Thus, there was substantial heterogeneity among these strains. Lower similarity among isolates was observed. This can be explaned due to possible mutation that can be caused by environmental or chemical factors.