Yüzey plazmon rezonans temelli immunoglobulin G sensörünün hazırlanması

Abstract

Sunulan çalışmanın amacı, IgG tayini için Fab fragmanları baskılanmış yüzey plazmon rezonans temelli biyosensör hazırlanmasıdır. Bu amaçla, SPR biyosensör allil merkaptan ile modifiye edilmiş ve allil gruplarının yönlenmesi sağlanmıştır. İlk basamakta, N-metakroil-(L)-histidin metil ester (MAH) monomeri, metakriloil klorür ve L-histidin metil esterin reaksiyonu ile sentezlenmiştir. Daha sonra IgG moleküllerinin papain enzimi ile enzimatik hidrolizi sonucunda Fab fragmanları elde edilmiştir. Kalıp molekül olarak kullanılan Fab fragmanları ve MAH monomeri ile ön kompleks hazırlanmıştır. Fab fragmanları baskılanmış SPR çipleri, farklı oranlarda EGDMA, HEMA, AIBN ve MAH-Fab kompleksi varlığında hazırlanmıştır. Ayrıca kontrol deneyi için kalıp molekül olan Fab fragmanları kullanılmadan aynı şekilde baskılanmamış SPR çipi de hazırlanmıştır. Hazırlanan SPR sensörler, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elipsometre, FTIR ve temas açısı ölçümleriyle karakterize edilmiştir. Kalınlık ölçümleri ve AFM görüntüleri, Fab fragmanlarının çip yüzeyine hemen hemen tek tabakalı olarak baskılandığını göstermektedir. Desorpsiyon çalışmaları, kesikli sistemde 1 M NaCl (20 mM, pH:7.0 fosfat tamponu) kullanılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Baskılanmış ve baskılanmamış sensörlerin Fab ve IgG tayin duyarlılığı, Fab ve IgG çözeltileri (pH: 7.0 fosfat tamponunda) ve seyreltilmiş plazma örnekleri ile araştırılmıştır. Baskılanmış sensörler, baskılanmamışlara göre Fab ve IgG'ye daha fazla duyarlılık göstermişlerdir. Farklı derişimlerdeki Fab ve IgG çözeltileri adsorpsiyon kinetiklerinin belirlenmesinde kullanılmıştır. Langmuir adsorpsiyon modeli, bu afinite sistemi için en uygun model olarak bulunmuştur ve sonuçlar baskılanmış SPR sensör yüzeyindeki IgG bağlanma bölgelerinin homojen dağılımlı ve tek tabakalı olduğunu göstermiştir. Fab baskılanmış sensörlerin seçiciliğini göstermek için Fab, IgG, sığır serum albümini (BSA) ve Fc fragmanlarının yarışmacı adsorpsiyonu araştırılmıştır. Sonuçlar, baskılanmış sensörün Fab ve IgG için yüksek seçiciliğe ve duyarlılığa sahip olduğunu göstermektedir.

The aim of this study is the preparation of Fab fragments imprinted surface plasmon resonance based biosensor for IgG detection. For this reason, SPR biosensor was modified with allyl mercaptane and the orientation of allyl groups was ensured. In the first step, MAH monomer was synthesized via a reaction between methacryloyl chloride and L- histidine methyl ester. Then, Fab fragments were obtained by the enzymatic hydrolysis of IgG molecules with papain enzyme. And preorganized complex was prepared with the template molecule Fab fragments and the monomer MAH. Fab fragments imprinted SPR chips were prepared in the presence of different amounts of EGDMA, HEMA, AIBN and MAH-Fab complex. Also non-imprinted SPR chips were prepared without Fab for control experiments. Prepared SPR chips were characterized with atomic force microscopy (AFM), ellipsometer, fourier transform infrared spectrophotometry (FTIR) and contact angle measurements. The thickness measurements and AFM observations indicated that the Fab fragments imprinted SPR surface was almost monolayer. Desorption studies were performed at batch system by using 1 M NaCl (20 mM, pH: 7.0, phosphate buffer). Fab and IgG sensing abilities of imprinted and non-imprinted SPR sensors were investigated from Fab and IgG solutions and diluted plasma samples (in pH: 7.0 phosphate buffer). Imprinted sensors showed more sensitivity to Fab and IgG than non-imprinted ones. Fab and IgG solutions with different concentrations were used to determine the adsorption kinetics. Langmuir adsorption model was found as the most suitable model for this affinity system and the IgG binding regions on the imprinted SPR sensor were found as homogenous and monolayer. In order to show the selectivity of the Fab imprinted sensor, competitive adsorption of Fab, IgG, bovine serum albumin (BSA) and Fc fragments was investigated. The results show that the imprinted sensor has high selectivity and sensitivity for Fab and IgG.