Aeromonas salmonicida EDT1`den proteaz enziminin üçlü faz ayırma sistemi ile saflaştırılması, karakterizasyonu ve biyoteknolojik uygulanabilirliğinin araştırılması

Abstract

Bu tez çalışması kapsamında Erzurum Söğütlü Mahallesi'nden Betbaşı, Karaçoban ve Geçitler gözelerinden temin edilen soğuk su örneklerinden toplam 10 adet psikrofilik bakteri izole edildi. İzolasyon sonrasında yapılan konveksiyonel ve moleküler analizler sonucunda 10 izolat (EDT1: Aeromonas salmonicida, EDT2,EDT14: Pseudomonas azotoformans, EDT3, EDT4, EDT7: Shewanella putrefaciens, EDT6: Shewanella profunda, EDT12: Pseudomonas psychrophila, EDT18, EDT19: Pseudomonas yamanorum) tür düzeyinde tanımlandı. Petri denemeleri sonucunda 2 suşun proteaz enzim aktivitesi bakımından pozitif olduğu gözlemlendi. En yüksek aktiviteyi ise Aeromonas salmonicida EDT1 izolatının verdiği tespit edildi. A.salmonicida EDT1 soğuk-aktif proteaz enzimi pH 7,0, 1,0:1,5 (ham enzim çözeltisi: t-Bütanol oranı) ve %80 doygun amonyum sülfat kullanılarak uygulanan üçlü faz ayırma sistemi (TPP) sistemi ile %244 verimle, 42 kat saflaştırıldı. Enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE ile yaklaşık 39,44 kDa olarak hesaplandı. Enzim için optimum pH 9,0 ve optimum sıcaklık 5°C olarak belirlendi. Enzimin 5°C'de 60 dakika sonunda aktivitesinin arttığı; 60. dakika'dan sonra ise aktivitesinin giderek azaldığı tespit edilmiştir. EDT1 proteaz enziminin aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde Mg2+ (1 mM), Na+ (5 ve10 mM) ve Mn2+ (10 mM) iyonları varlığında enzimin aktivitesini artırdığı; Fe2+, Ca+2 ve Li+ iyonları varlığında ise enzimin inhibe olduğu gözlemlendi. Enzimin serin proteaz inhibitörü PMSF ile inhibe olduğu; %5'lik β-merkaptoetanol'ün enzimin aktivitesini artırdığı belirlendi. Soğuk-aktif alkalin proteaz enziminin aktivitesinin, 1 saatlik inkübasyon süresi sonunda aseton (%50) ve izopropanol (%15-50) varlığında arttığı; 24 saatlik inkübasyon sonunda ise organik çözücülerde aktivesini koruyamadığı fakat %50'lik t- bütanol varlığında % 153 oranında artırdığı tespit edildi. %5'lik SDS konsantrasyonunda enzimin aktive olduğu; %1lik TritonX100 varlığında ise % 77 oranında aktivitesini korunduğu belirlendi. Enzim, en yüksek aktiviteyi kazein subsratı için gösterdi. A.salmonicida EDT1 enzimi için KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,751 mg/ml, 43,29 mmol.ml-1.dk-1 ve olarak hesaplandı. Enzimin en fazla Ariel markalı deterjanda dayanıklı kaldığı gösterildi. Biyoteknolojik uygulanabilirliği için kan ve çimen lekeleri üzerine uygulandı. Islak/kurutulmuş kan ve çimen lekesi örnekleri için en iyi leke gideriminin sırasıyla 1 saatlik inkübasyon sonucunda enzim ve deterjan uygulanan grupta olduğu gösterildi.

Within the scope of this thesis, a total of 10 psychrophylic bacteria were isolated from the cold-water samples obtained from the water sources of Betbaşı, Karaçoban and Geçitler from Erzurum Söğütlü neighborhood. After isolation, 10 isolat type levels were defined (EDT1: Aeromonas salmonicida, EDT2, EDT14: Pseudomonas azotoformans, EDT3, EDT4, EDT7: Shewanella putrefaciens, EDT6: Shewanella profunda, EDT12: Pseudomonas psychrophila, EDT18, EDT19: Pseudomonas yamanorum) as a result of convector and molecular analyses. As a result of the Petri trials, it was observed that 2 strains were positive in terms of protease enzyme activity. The highest activity was determined by Aeromonas salmonicida EDT1 isolates. The triple phase partitioning system was applied with using A.salmonicida EDT1 cold-active protease enzyme pH 7,0, 1,0:1,5 (Crude enzyme solution: t-butanol ratio) and 80% saturated ammonium sulfate using (TPP) system, and it was not only 244% efficiency, but also 42 times were purified. The molecular mass of the enzyme was estimated at approximately 39.44 kda with the SDS-PAGE. Optimum pH 9,0 and optimum temperature at 5 °C for protease enzyme were determined. At the end of 60 minutes, the enzyme activity increased at 5 °C, after 60 minutes, the activity decreased gradually. When the effect of metal ions on the activity of EDT1 protease enzyme is examined, the enzyme activity in the presence of Mg2+ (1 mM), Na+ (5 and 10 mM) and Mn2+ (10 mM) ions was increased. However, in the presence of Fe2+, Ca+2 and Li+ ions, it was observed that the enzyme activity was inhibited. The serine protease inhibitor of the enzyme was strongly inhibited with PMSF; although, 5% β-mercaptoethanol increased enzyme activity, in the presence of other inhibitors it was determined that the enzyme could not preserve its activity. At the end of the 1-hour incubation period, the activity of the protease enzyme increased in the presence of acetone (50%) and isopropanol (15-50%); at the end of 24-hour incubation, it was determined that it could not maintain its activity in organic solvents but enzyme activity was increased by 153% in the presence of 50% t-butanol. In the 5% SDS concentration, the enzyme was activated; in the presence of TritonX-100% 1%, it was determined that the enzyme activity preserved at a rate of 77%. For the enzyme of A.salmonicida EDT1, the KM and Vmax values were calculated respectively 0,751 mg/ml, 43,29 mmol.mL-1.dk-1. A.salmonicida EDT1 Enzyme was applied to the commercial detergent application. The enzyme was shown to be resistant to the most Ariel-branded detergent. It was applied on blood and grass stains for biotechnological applicability. A result of 1 hour of incubation of of wet/dried blood and grass stains, the best stain treatment was shown to be in the group that enzyme and detergent applications were made.