Yeni bir on-line HPLC-CA inhibitör belirleme yönteminin geliştirilmesi ve biyoaktif bitki ekstraktlarına uygulanması

Abstract

Karbonik anhidraz (CA) inhibitörleri (CAI) çeşitli tedavilerde kullanılmaktadır. Doğal CAI araştırmaları giderek artan oranda ilgi görmektedir. Doğal biyoaktif bileşenlerin tespitinde on-line HPLC uygulamaları önemli avantajlar sunmaktadır. Ayrılan bileşenlerin aktivitelerinin belirlenmesinde antioksidan ve enzim inhibisyon araştırılması en fazla karşılaşılan çalışmalardır. Bu çalışmada 17 bitkiden üç çözücüyle hazırlanan 51 ekstraktın CAI aktiviteleri belirlenmiş ve yeni on-line (kombine) HPLC-DAD-CAI yöntemi geliştirilmiştir. Klasik ve HPLC yöntemlerinde kullanılabilen beş çözücünün (metanol, etanol, aseton, asetonitril, DMSO) CA aktivitesi üzerine etkisi araştırılmıştır. Öncelikle sığır CA'sı (BCA), insan hCA-I ve hCA-II izoenzimleri afinite kromatografisiyle eritrositlerden saflaştırılmış, diyaliz ve liyofilizasyon sonrası SDS-PAGE kullanılarak saflık kontrolü yapılmıştır. Beş çözücünün CA enzimlerinin esteraz ve hidrataz aktivitelerini azalttığı gözlemlenmiştir. %10-15 çözücü konsantrasyonlarına kadar aktivitenin değerlendirilebileceği tespit edilmiştir. Bitki ekstraktlarının CA enzimlerinin esteraz ve hidrataz aktivitelerini baskıladığı belirlenmiştir. Ayrıca bu ekstraktların toplam fenolik madde miktarları da belirlenmiştir. Bu iki ölçüm arasında korelasyon olduğu görülmüştür. Hidrataz ve esteraz aktivite inhibisyon verilerinde de ileri derecede uyum görülmüştür. Çözücünün inhibitör bileşiklerin etkilerinde yapabileceği değişiklik de araştırılmıştır. On-line HPLC sisteminde etkili olabilecek sıcaklık, pH, tampon konsantrasyonu spektrofotometrik yöntemle esteraz aktivitesi için araştırılmış ve uygun şartlar belirlenmiştir. Standart inhibitörler sülfanilamid ve asetazolamid kullanılarak on-line HPLC-DAD-CAI yöntemi geliştirilmiş, yöntemle konsantrasyonu bilinen bileşiğin tek konsantrasyonda uygulamayla IC50 değerinin nasıl belirlenebileceği gösterilmiştir. Daha önce geliştirilmiş olan on-line HPLC-FRAP antioksidan yöntemi CAI yöntemiyle birlikte kullanılarak kombine HPLC-DAD-FRAP-Spektrofotometrik CAI yöntemi uygulaması yapılmış, yöntemin getirdiği avantajlar ortaya konmuştur. Seçilen bitki ekstraktları geliştirilen yöntemle değerlendirilmiştir. Geliştirilen yöntemin yüksek aktiviteye sahip, IC50 değeri 50 μM'ın altında olan klinik değeri yüksek bileşiklerin tespitinde kullanılabileceği ortaya konmuştur.

Carbonic anhydrase inhibitors (CAI) are used in various therapies. Investigating natural CAIs attract increasing attention. On-line HPLC applications provide advantages in identifying bioactive compounds. Antioxidant and enzyme inhibitory studies with separated compounds are frequently encountered. In this study, CAI activities of 51 extracts prepared with three solvents from 17 plants were determined, and new on-line (combined) HPLC-DAD-CAI method was developed. Effect of solvents (methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, DMSO) used in classical and HPLC methods on CA activities was tested. Bovine CA (BCA), human hCA-I and hCA-II isozymes were isolated from erythrocytes by affinity chromatography; purity was checked with SDS-PAGE after dialysis and lyophilization. Solvents decreased esterase and hydratase activities of CAs. Activities could be evaluated below 10-15% solvent concentrations. Extracts inhibited esterase and hydratase activities. Extract total phenolic contents were also determined. Results of two measurements correlated. High correlation was observed between esterase and hydratase inhibitions. Change on effect of inhibitors by solvents was studied. Temperature, pH and buffer concentration were evaluated for on-line HPLC using spectrophotometric esterase activity, and appropriate conditions were determined. On-line HPLC-DAD-CAI method was developed using standard inhibitors sulfanilamide and acetazolamide; IC50 value of compounds of known concentration was determined with single concentration run. Previously developed on-line HPLC-DAD-FRAP antioxidant method was combined with CAI method, and advantages of combined HPLC-DAD-FRAP-Spectrophotometric CAI method were explored. Selected extracts were evaluated with the developed method. The new method can be utilized in identification of high activity CAI compounds with IC50 values lower than 50 μM with high clinical value.