Cytochrome C purification with surface imprinted bacterial cellulose nanofibers

Abstract

Bu çalışmada, sitkrom c saflaştırma ve tanıma işlemleri için yüzey baskılamayöntemi ile sitokrom c baskılanmış bakteriyel selüloz (Cyt c-MIP) nanofiberlerhazırlanmıştır. N-metakriloil L-histidin metil ester (MAH) monomeri spesifik tanımabölgeleri oluşturmak için sentezlenmiştir. MAH monomeri ile bakır (II) iyonuarasında kompleks oluşumundan sonra metal iyon koordinasyon etkileşimlerikullanılarak MAH-Cu(II) monomeri ve sitokrom c hedef molekülleri ile önkomplekshazırlanmıştır. Cyt c-MIP nanofiberler farklı % toplam monomer oranlarında, farklımonomer/hedef molekül molar oranlarında ve farklı polimerizasyon sürelerindehazırlanmıştır. Cyt c-MIP nanofiberler ATR-FTIR, SEM ve temas açısı ölçümleri ilekarakterize edilmiştir. Adsorplanan protein moleküllerinin polimer yapıdandesorpsiyonu için 1 M NaCl çözeltisi kullanılmıştır. Adsorpsiyon çalışmaları pH,sıcaklık ve iyonik şiddete göre gerçekleştirilmiştir ve adsorpsiyon kapasitesispektrofotometrik olarak analiz edilmiştir. Uygun denge izotermi Langmuir izotermiolarak belirlenmiştir. Bu sistem için hız sınırlayıcı basamağın kimyasal reaksiyonolmasından dolayı yalancı-ikinci derece kinetik modelin bu sisteme daha uygunolduğu belirlenmiştir. Cyt c-MIP nanofiberlerin seçiciliğinin değerlendirilmesi içinhedef moleküle benzer yapıda olan sığır serum albumin, hemoglobin, miyoglobiniive lizozim kullanılmıştır. Metal iyon koordinasyonu etkileşimlerinin spesifikbağlanma bölgeleri hazırlanmasında katkısının olduğu tespit edilmiştir. Busonuçlar hedef proteini baskılama işleminin yüksek adsorpsiyon kapasitesi ilebaşarılı bir şekilde gerçekleştiğini göstermiştir. Cyt c-MIP nanofiberlerin bağlanmaözellikleri ayrıca QCM sensör çalışmaları ile de değerlendirilmiştir. Bu kapsamdaQCM nanosensörler Cyt c-MIP nanofiberler ile hazırlanmış ve kinetic ve seçicilikçalışmalarında kullanılmıştır. Bu nanosensörler AFM ile karakterize edilmiştir.Bağlanma özelliklerinin belirlenmesi için kinetik ve bağlanma sabiti Scathard,Langmuir, Freundlich ve Langmuir-Freundlich izotermleri ile hesaplanmıştır. Eldeedilen sonuçlar kesikli sistemde bağlanma çalışmalarının sonuçları ileörtüşmektedir.

In the present study, cytochrome c imprinted bacterial cellulose (Cyt c-MIP)nanofibers were prepared for the purification and recognition of cytochrome c viasurface imprinting approach. N-methacryloyl-L-histidine methyl ester (MAH) wassynthesized to create specific binding sites. After the complexation between MAHand chelating metal ion copper(II), the preorganized complex was prepared withMAH-Cu(II) monomer and Cyt c template molecules via metal ion coordinationinteractions. Cyt c-MIP nanofibers were prepared in the presence of differentamounts of %w total monomer, monomer/template ratio and polymerization time.Cyt c-MIP nanofibers were characterized by ATR-FTIR, SEM and contact anglemeasurements. In order to desorp the adsorbed proteins from the polymernetwork, 1 M NaCl solution was used. Adsorption studies were performed withrespect to pH, temperature and ionic strength and the adsorption capacity wasevaluated spectrophotometrically. The suitable equilibrium isotherm wasdetermined as Langmuir isotherm. It was determined that pseudo-second orderkinetic model was more suitable to this system referring chemical reaction as arate limiting step. To evaluate the selectivity of the Cyt c-MIP nanofibers, similarproteins were utilized as non-template proteins, which were bovine serum albumin,ivhemoglobin, myoglobin and lysozyme. The metal ion coordination interactionswere found to contribute for the fabrication of specific recognition binding sites.The results present the successful imprinting of the template protein with highadsorption capacity. The binding properties of Cyt c-MIP nanofibers were alsoevaluated with QCM sensor studies. In this context QCM nanosensors wereprepared with Cyt c-MIP nanofibers and used for further kinetic and selectivitystudies. These nanosensors were characterized by AFM. In order to determine thebinding characteristics, kinetic and binding constant were calculated withScathard, Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich isotherms. The resultswere conformable with the results of batch rebinding studies.