Atık sulardan fenolik bileşiklerin uzaklaştırılması için yeni nesil destek malzemeleri

Abstract

Atık su arıtımı, yasal sınırlamaların ötesinde, ekosistem ve insan sağlığını korumak için gereklidir. Demir-çelik, petro-kimya, boya, ilaç vb. endüstrilerde yaygın kullanım alanına sahip olması fenol ve türevlerini atık sular için başlıca kirleticilerden yapmaktadır. Sunulan çalışmada atık sulardan fenolik bileşiklerin enzimatik yükseltgeme yöntemi ile arıtımı hedeflenmiştir. Enzimatik yükseltgeme tekniğinde, elektron alıcısı olarak moleküler oksijeni kullanarak çeşitli fenolik bileşikleri yükseltgeyebilme yeteneğinden dolayı Trametes versicolor lakkazın kullanımı tercih edilmiştir. Üretim maliyetini düşürmesi, tekrar kullanılabilirliği, depolama kararlılığı ve tepkime sonunda ortamdan kolaylıkla uzaklaştırılabilmesi gibi avantajlarından dolayı serbest enzim yerine immobilize enzim kullanımı tercih edilmiştir. Yığın polimerizasyonu tekniği ile sentezlenen makrogözenekli poli(glisidil metakrilat) [P(GMA)] kriyojeli lakkaz enzimi immobilizasyonunda kullanılmak üzere yeni bir destek malzemesi olarak hazırlanmıştır. Kriyojelin sentezi çapraz bağlayıcı EGDMA (etilenglikol dimetakrilat) varlığında, GMA (glisidil metakrilat) ve HEMA (2-hidroksietil metakrilat) komonomerlerine APS (amonyum persülfat) ve TEMED (N,N,N',N'-tetra-metiletilendiamin) başlatıcı ve aktivatör çiftlerinin ilave edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Destek malzemesi olarak kullanılmak üzere sentezlenen P(GMA) kriyojeline lakkaz immobilizasyonu, GMA epoksi gruplarına lakkaz amino gruplarının nükleofilik saldırısı sonucu kovalent bağlanma yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Fourier dönüşümlü kızılötesi spektrofotometresi (FTIR) ile enzim immobilizasyonu ile P(GMA) kriyojelinde meydana gelen yapısal değişiklikler saptanmıştır. Ayrıca makrogözenekli kriyojelik destek malzemesi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve şişme testleri ile karakterize edilmiştir. 24 saat lakkaz ile inkübe edilen P(GMA) kriyojelinin şişme değeri % 572 olarak bulunmuştur. Lakkaz aktivite tayini substrat olarak kullanılan ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiyazdin-6-sulfonik asit)) sulu çözeltileriyle farklı ortam koşullarında kesikli sistemde belirlenmiştir. pH, tepkime süresi, sıcaklık, enzim derişimi, substrat derişimi ve depolama süresinin immobilize enzimin aktivitesi üzerine etkisi belirlenmiş ve serbest enzim ile karşılaştırılmıştır. Arrhenius eşitliğinden yararlanarak tepkime aktivasyon enerjisi (Ea) serbest ve immobilize lakkaz için sırasıyla 27.0 kJ.mol-1 ve 28.8 kJ.mol-1 olarak hesaplanmıştır. Serbest lakkaz için Km ve Vm değerleri sırasıyla 165.1 µM ve 55.2 µM.dak-1, immobilize lakkaz için ise Km ve Vm değerleri sırasıyla 156.0 µM ve 1.57 µM.dak-1 olarak Lineweaver-Burk grafiği ile belirlenmiştir. Ayrıca immobilize enzimin 6 kez kullanım sonrası başlangıç aktivitesini % 82.5 oranında ve dört haftalık depolama periyodu sonunda aktivitesini % 72.0 oranında koruduğu saptanmıştır. Serbest enzim için ise dört haftalık depolama sonrası korunan aktivite başlangıç değerinin % 24.0'üdür. Çalışmanın son basamağında sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LCMS/MS) kullanılarak sulu çözeltideki model fenolik bileşiğin (3,5-dinitrosalisilik asit) lakkaz ile enzimatik yükseltgemesi sonrasındaki parçalanma ürünleri belirlenmiştir.

Wastewater treatment, apart from the legal limitations, is essential for preservation of the ecosystem and human health. Phenol and its derivatives, with their intensive use in industries such as iron and steel, petrochemicals, dyes, medicines, etc. are the main constituents of pollution for wastewater. The present study aims at purification of phenolic compounds in wastewater by enzymatic oxidation method. Trametes versicolor laccase, due to its ability in oxidation of phenolic compounds through combining with molecular oxygen as an electron acceptor, was preferably used in enzymatic oxidation technique. Due to such advantages as low production cost, re-usability, storage stability and easy removal from the medium after the reaction, immobilized enzyme rather than free enzyme was used. Macroporous poly(glycidyl methacrylate) [P(GMA)] cryogel synthesized by bulk polymerization was prepared as a novel support material in laccase enzyme immobilization. Cryogel synthesis was realized in the presence of crosslinker EGDMA (ethylene glycol dimethacrylate) by the addition of APS (ammonium persulfate) and TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine) initiator and activator couples onto GMA (glycidyl methacrylate) and HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate) comonomers. Laccase immobilization onto P(GMA) cryogel, synthesized as support material, was attained through covalent bonding method by the nucleophilic attack of laccase amino groups to GMA epoxy groups. The structural changes in P(GMA) cryogel due to enzyme immobilization was determined by Fourier transformed infrared spectrometer (FTIR). The macroporous cryogel support material was also characterized by scanning electron microscope (SEM), and swelling test. The swelling ratio of P(GMA) cryogel following an incubation period of 24h with laccase was determined to be 572%. Laccase activity was determined in batch system under different conditions using aqueous solutions of ABTS (2.2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) as substrate. The effect of pH, reaction time, temperature, enzyme concentration, substrate concentration, and storage period on immobilized enzyme activity was determined and compared with those of free enzyme. Reaction activation energy (Ea) was calculated using Arrhenius equation as 27.0 kJ.mol-1 and 28.8 kJ.mol-1 for free and immobilized laccase, respectively. Km and Vm values were determined by Lineweaver-Burk diagrams as 165.1 µM and 55.2 µM.min-1 for free laccase and 156.0 µM and 1.57 µM.min-1 for immobilized laccase, respectively. Immobilized enzyme was determined to retain 82.5% of the original activity level following 6 repeated use and 72.0% following a storage period of 4 weeks. The free enzyme retained only 24.0% of its original activity following the same storage period. Lastly, decomposition products resulting from enzymatic oxidation of a model phenolic compound (3,5-dinitrosalicylic acid) by laccase in aqueous solution were identified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).