Examination and mathematical modelling of shrinkage rate of uniform droplets in a microfluidic system designed for biopreservation

Abstract

Biyo-saklama günümüzde klinik tıp, doku mühendisliği, aşı, gıda, tarım ve kozmetik gibi alanlarda önemi giderek artan bir alandır. Biyo-saklama için çok çeşitli yöntemler uygulanmaktadır. Bunlar arasında canlı-dışı besi ortamında (in-vitro culture) saklama, düşük sıcaklıkta (hypothermic) saklama, dondurarak (cryopreservation) saklama ve kurutarak (dry-preservation) saklama sıralanabilir. Bu yöntemlerin kullanılmasındaki öncelikli amaç saklama öncesinde ve saklama süresince hücrede kalıcı bir hasar yaratmadan koruma sağlanmasıdır. Günümüzde dondurarak ve kurutarak saklama, özellikle hassas memeli hücrelerinin uzun süreli saklanması, üzerinde yoğunlukla çalışılması ve yeni yöntem ve teknolojiler geliştirilmesi gereken alanlardır. Bu yöntemler geliştirilirken örneklerin saklanması veya bir yerden bir yere taşınmasının da kolay ve düşük masraflı olması gözetilmek durumundadır. Dondurarak ve kurutarak saklama yöntemleri doğadaki örnekler izlenerek geliştirilmiştir. Bazı canlılar ortamdaki sıcaklık değişimleri veya donma/kuruma etkilerinin yarattığı gerilimlerin artmasıyla birlikte vücutlarında karbohidrat sentezler. Sentezlenen karbohidrat soğuk/kuraklık zamanında hücrenin zarar görmeden korunmasına olanak sağlar. Memeli hücreleri evrimsel olarak kuru veya dondurarak saklamaya imkan verecek nitelikte gelişmemiştir. Bu koşulların yerine getirilmesi için koruyucu maddelerin dışarıdan eklenmesi gerekmektedir. Memeli hücreleriyle ilgili yapılan çalışmalar sonucu gliserol, trehaloz gibi karbohidratların düşük oranda kullanıldığı sürece uygun koruyucular olduğu tespit edilmiştir. Hücre içine giren karbohidratlar yüksek camsı geçiş sıcaklığına sahip olduğundan düşük sıcaklıklarda veya oda koşullarında vitrifiye ederek saklama imkanı sunmaktadır. Hücrelerin vitrifiye edilmesinde en büyük engellerden biri donmaya karşı kullanılan ve camsı geçiş sıcaklığını yükseltmeye yarayan koruyucu kimyasallara yüksek derişimde ihtiyaç duyulmasıdır. Bu kimyasallara hücrenin uzun süre maruz kalması sonucu toksik etkilerinden dolayı hücreler zarar görmektedir. Dolayısı ile sistemin, camsılaşma öncesinde koruyucu madde etkilerine olabilecek en düşük sürede maruz kalması sağlanmalıdır. Bahsedilen etkiler koruyucu kimyasalların kontrollü biçimde hücreye verilmesiyle asgari boyutlara çekilebilir. Çalışma kapsamında gliserol koruyucu madde olarak seçilmiştir. Ancak kurulan model hücre zarından geçebilen her madde için uygulanabilecek şekilde geliştirilmiştir. Çalışmada, sulu ortamda hücrelerin mikro-boyutlu küresel damlacıklar içinde hapsedilmesi sağlandıktan sonra sıcaklığa bağlı olarak organik fazın su çözünürlüğünün artması ile damlacıkların vitrifiye edilmesi için gerekli konsantrasyon değerine ulaşma koşulları incelenmiştir. Şekil-1'de kurulan sistemde tek bir damlacığın görünümü verilmiştir. Çalışmada suyun diğer faza yayınım hızı ve buna etki eden faktörler en önemli parametreler olarak öne çıkmaktadır.Bu uygulamada diğer önemli husus genellikle yağlardan oluşan organik fazdır. Kütlece %0.3 miktarda suyu çözebilmesi, maliyeti düşük olması ve toksik etki yaratmaması soya yağını damlacık içindeki su miktarını sıcaklığa bağlı kontrol etmede ideal bir organik faz olarak öne çıkmaktadır.Bu çalışmada bir mikro-akışkan sistemde oluşturulan eşboyutlu damlacıkların sıcaklığa ve dolayısı ile suyun organik faz icine yayınım hızına bağlı olarak küçülme hızı incelenirken, sulu damlacıkların içerdiği kimyasal derişiminin artışı incelenmek istenmektedir. Geleneksel dondurarak hücre saklama yöntemlerinde hücrelere koruyucu madde yükleme işi kademeli olarak yapılmaktadır. Kademeli olarak koruyucu madde yüklemek tek seferde koruyucu madde yüklemekten daha az zararlı olsa da, halen geliştirilmeye ihtiyacı vardır. Çalışmada, Dr. Mehmet Toner'in araştırma grubu tarafından hücrelere CPA yüklenmesi amacı ile geliştirilen ve hücreleri düşük ozmotik basınca maruz bırakmayı amaçlayan bir mikro-akışkan düzenek incelenmiştir. İncelenen cihaz iki tane mikro kanalın birbiri ile dik olarak kesişmesinden oluşmaktadır. Akış sağlanırken aynı doğrultudaki iki kanaldan birbirine ters yönde yağ gönderilmektedir. Yağın gönderildiği kanallara dik olan üçüncü kanaldan ise daha düşük akış hızı ile su gönderilir. Su damlalar halinde doygun yağ fazına karışmadan geçer. Yağ akışının içinde oluşan su damlaları suyun akış yönünde itilerek dördüncü kanala doğru akar ve duzenli biçimde yağ içerisinde akan su damlaları elde edilir. Damlaların boyutu kanalların boyutlarına bağlı olarak değişirken, birim zamanda oluşan su damlacığı sayısı yağ ve suyun akış hızları ile bağlantılıdır. Düzeneğin yapımında özellikle yapışmayı önlemek amacı ile hidrofobik bir yüzey sağlayan poli-dimetil-siloksan (PDMS) tercih edilmiştir. PDMS'in bir başka özelliği olan şeffaflık ışık ve floresan mikroskopları ile analizlerinin yapılabilmesi açısından önem teşkil etmektedir. İncelenen sistem için matematiksel bir model geliştirilmiş damlacıkların küçülme hızı diğer parametrelere bağlı olarak gösterilmiştir. Çalışmada madde yayılımını matematiksel olarak tanımlamak için Fick madde dağınım yasası ve devamlılık denkleminden türetilmiş olan yığın taşınım ve difüzyon denkliği (convection-diffusion equation) kullanılmıştır. Akış dinamiklerini tanımlamak için Navier-Stokes denkliklerinin süreklilik versiyonlarından yararlanılmıştır. Akış profilini elde etmek için hareket denkleminden yararlanılmış, Reynold Sayısı 1'den küçük olduğu durumlarda geçerli olan laminar akış dinamikleri uygulanmıştır. Hücre zarından geçişin matematiksel açıklaması için bugün yaygın olarak kullanılan, ilk olarak 1932'de Jacobs M.H. tarafından ortaya atılan 2-parameter formalism (2 parametreli formalizm) modeli kullanılmıştır. Bahsedilen matematiksel çözümlemeler Comsol Multiphysics yazılımı kullanılarak yapılmıştır. Buna ek olarak Comsol ile entegre veya uyumlu çalışabilmesinden dolayı MATLAB ve MS Excel yazılımları, basit kontrol hesapları ve değişkenlerin grafikler üzerinden ilişkilendirilmesi amacı ile kullanılmıştır. Matematiksel model Şekil-6'da verilen algoritma takip edilerek adım adım çözülmüştür. Kütle aktarımı Comsol Multiphysics yazılımı içerisinde bulunan Transport of Diluted Species modülü, akış dinamikleri Laminar Flow modülü, damlacıkların küçülmesi Moving Mesh modülü ile tanımlanmıştır. Ulaşılan akış ve derişim profilleri Şekil-4 ve Şekil-5'de verilmiştir.Sistemdeki değişkenlerden damlacık yarıçapı, damlacıklar ve organik fazın ortalama hızı arasındaki ilişkiyi anlatan bağıl hızı etkilemektedir. Bağıl hız, suyun organik faza geçiş akısını etkilemektedir. Akı ise, damlacık yarıçapın değişimini etkilemektedir. Bu döngüsel bağlantı ancak döngüsel bir hesaplama ile çözülebilmiştir. Buradan elde edilen sonuçlar damlacık içerisindeki derişimi bulmak için kullanılmış, daha sonra hücre zarından geçiş hesaplarıyla beraber hücre içi koruyucu madde derişimini veren Cintracellular değişkeni bulunmuştur. Bu algoritma ve içerdiği denklikler şekil-6'da verilmiştir.Sonuç olarak, 150x200µm kesitli kanallar ile çalışılırken, 90 mikrondan küçük boyutlardaki sulu damlacıklar ile çalışılmasının en yüksek verimliliği sağlayacağı bulunmuştur. En iyi damlacık boyutu çalışma aralığı olarak 85 – 40 mikron aralığı bulunmuştur.85 mikron ile sürece başlandığında, teorik olarak, 300 saniyeden kısa sürede koruyucu madde başlangıç derişiminin 10 katına çıkarılabileceği görülmüştür. Akış hızının daha yüksek değerlere çekilmesinin kütle transfer hızını arttıracağı sonucuna varılmıştır. Ancak, bütün bu kütle transfer sisteminde sınırlayıcı yer hücre zarıdır. Damlacık içerisindeki derişim miktarı hızlı bir biçimde arttırılsa da, hücre zarından geçiş hızı derişimin artış hızını dengeleyecek biçimde artmayacaktır. Bu durum hücre zarının dışında madde birikimne yol açabilir ve hücrenin yüksek derişim farkına maruz kalması sonucu kullanılan cihazın amaçlarından biri olan hücreye düşük osmotik basınç uygulama söz konusu olmaktan çıkabilir. Sulu damlacık içerisindeki derişim artışı hücre zarından madde geçiş hızı ile uyumlu olacak seviyede tutulmalıdır. Şekil-8 de incelenen sistemde derişimi arttırmak için teorik olarak geçmesi gereken süre verilmiştir.Yazında hücre zarından madde geçişini tanımlayan teorik modeler bulunmaktadır. Çalışmamız sonucunda görülmüştür ki, hücrelerin ortamdaki derişim farklılıklarına vereceği tepkileri sürekli bir sistemde eksiksiz açıklayan bir model bulunmamaktadır. Yazındaki modeler ya hücre hacmini sabit kabul etmekte ya da değişen hücre hacminin hücre içi derişimi etkilemediğini kabul etmektedir. Deneysel verilerden bağımsız olarak hücrenin derişim farkına anlık olarak vereceği tepkiyi açıklayan bir modelin eksikliği farkedilmiş ve gelecekte araştırmaya değer bir konu olarak görülmüştür.

Preserving biomaterials at low temperatures requires the use of carbohydrates as cryo-protective agents (CPAs) at high concentrations to increase the glass transition temperature, thus preventing the formation of extra- and intra-cellular ice formation at the cost of toxicity. In this thesis, we developed a mathematical model to investigate a microfluidic method proposed by Dr. Mehmet Toner for pre-concentration of cells with CPAs in continuous flow under fewer mechanical and osmotic stresses than traditional methods. New method is based on trapping cells into aqueous droplets and controlling the CPA concentration in the droplet by adjusting the temperature of the system. A water immiscible organic phase, which can solve small amounts of water, is utilized to remove water from the cell containing aqueous droplets. We solved the mathematical model based on two-phase flow and mass transfer through a moving boundary layer using Finite Element Analysis calculations on Comsol software together with external functions from MATLAB and Excel. The model showed that it is possible to pre-concentrate mammalian cells with CPAs to 10 times the initial concentration below 4 minutes via the BioMEMS based microfluidic method. We determined the critical droplet sizes for specific channel widths for optimum removal of water from the aqueous droplets. Since membrane is the limiting media for diffusion, the CPA concentration should always be increased in a matched rate of diffusion through the cell membrane to avoid large concentration differences over the cell membrane. For a channel with a cross-section of 150 µm x 200 µm, the ideal initial aqueous droplet size to yield a maximum rate of increase in CPA concentration would be 90 microns. Finally, it is emphasized that, there is significant need for a mathematical model to include the volumetric response of the cell to concentration gradients ahead of the cell wall through an advanced model for diffusion through the cell membrane.