Invertebrate ırıdescent vırus 6 (IIv6) genlerinin transkripsiyonel analizi ve transaktivatör protein(ler)inin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)'ya ait genlerin transkripsiyonel sınıflarının belirlenmesi, genlerin yukarı bölgelerinde muhtemel promotor görevi yapabilecek korunmuş bölgelerin tespit edilmesi ve en erken genlerin transkripsiyonunu başlatan protein(ler)in araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada ilk olarak, IIV6'nın şu ana kadar transkripsiyonel olarak sınıflandırılmamış 159 genin transkripsiyon sınıfları RT-PCR tekniği ile belirlendi. Bu genlerin 114 tanesinin en erken (IE), 23 tanesinin gecikmiş erken (DE) ve 22 tanesinin de geç (L) gen sınıfına ait oldukları belirlendi. İkinci olarak, IIV6'nın tüm genlerinin translasyon başlangıç noktalarından itibaren 200 nükleotit yukarı bölgeleri, promotor görevi yapabilecek korunmuş bölge bakımından MEME Suite veritabanı kullanılarak analiz edildiler. IE genler için TAAAATTGAA, DE genler için TTTTATGG, L genler için de TCAATTTT ve NNTTGT motifleri belirlendi. IE ve DE genler için bu motifler silindiğinde promotor aktivitelerinde önemli ölçüde azalma görülürken, L genlerde ise promotor aktivitesinde önemli derecede artış meydana geldi. Yönlendirilmiş mutagenez çalışmaları L genlerdeki NNTTGT motifinin genin transkripsiyonu üzerinde baskılayıcı görev yaptığını ve L gen promotoru olarak belirli bir motifin değil belirli uzunlukta bir bölgenin görev yapabileceğini gösterdi. Çalışmada son olarak, virüsün konak hücrede enfeksiyonu başlatabilmesi için gerekli olan yapısal protein(ler) araştırıldı. Araştırma southwestern, kotransfeksiyon, DNA afinite kromatografisi ve biyoinformatik analizler yapılarak gerçekleştirildi. Sonuçlar IIV6 IE gen transkripsiyonunun başlatılmasında tek bir proteinin değil muhtemel bir protein kompleksinin görev yaptığını gösterdi. Bu komplekste görevli muhtemel proteinlerden birinin, yaklaşık 13,5 kDa büyüklüğündeki güçlü DNA bağlanma domainine sahip olan 366R olduğu belirlendi.

In this study, it was aimed to identify the transcriptional classes of Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) genes, detect the conserved regions that could act as promoters in the upstream regions of the genes and investigate the protein(s) that initiate the transcription of the immediate early genes. In the study firstly, the transcription classes of 159 genes of IIV6 genes that have not been classified at transcriptional level to date were determined by RT-PCR technique. It was determined that 114 of these genes belong to immediate early (IE), 23 of them belong to delayed early (DE) and 22 of them belong to late (L) gene classes. Secondly, 200 nucleotide upstream regions, starting from translation initiation site, of all IIV6 genes were analyzed using the MEME Suite database in terms of the conserved region that could act as promoter. TAAAATTGAA motif was determined for IE genes, TTTTATGG for DE genes, TCAATTTT and NNTTGT motifs were determined for L genes. The deletion of these motifs for the IE and DE genes showed a significant decrease in promoter activity, whereas a significant increase in L genes. Site-directed mutagenesis studies showed that the NNTTGT motif in L genes acts as a suppressor on the transcription of the gene, and that a region of a certain length rather than a specific motif can act as a promoter for L gene. Finally, the structural protein(s) required for the virus to initiate infection in the host cell were investigated. The investigation was performed using southwestern, co-transfection, DNA affinity chromatography and bioinformatic analysis. Results showed that a possible protein complex, not a single protein, was involved in the initiation of IIV6 IE gene transcription. One of the possible proteins involved in this complex was found to be 366R with a strong DNA binding domain of about 13,5 kDa.