Kornea doku mühendisliği için polimerik ve deselülerize edilmiş matrikslerin hazırlanması

Abstract

Tez çalışmasının amacı sentetik ve polimerik malzemelerden oluşan biyouyumlu kornea doku iskelelerinin hazırlanmasıdır. Tez kapsamında yapılan çalışmalar üç başlık altında incelenebilir. İlk başlıkta kornea doku iskelesi olarak zenogreft kullanımı planlanmıştır. Zenogreftlerin elde edilmesi için farklı deselülerizasyon yöntemleri denenmiştir. Denenen üç farklı deselülerizasyon yöntemin iki yöntem literatürde bulunurken üçüncü yöntem yeni bir deselülerizasyon yöntemidir. Deselülerizasyon yöntemi için kimyasal ajan, enzimatik ajan ve süperkritik akışkan kullanılmıştır. Bu denemelerde histolojik ve floresan boyamalar yapılmış deselülerizasyon yöntemleri kendi aralarında karşılaştırılmıştır. Kimyasal yöntem deselülerizasyonunda DNA ve GAG ölçümü kantitaf olarak hesaplanmıştır. Yapılan çalışmalar yumuşak doku olan korneada süperkritik akışkan ile deselülerizasyonda düşük basınç ve sıcakta hücrelerin uzaklaştırılamadığı, kimyasal ve enzimatik yöntemlerde hücre uzaklaşmasının gerçekleştiği, bu ki grupta hücre uzaklaşmasının kimyasal yöntemde daha başarılı olduğu ve kimyasal yöntemle olan uzaklaşmada dokunun ECM yapısında değişik olduğu görülmüştür. Çalışmanın ikinci kısmında ise sentetik ve doğal polimerlerden doku iskeleleri oluşturulmuştur. Doğal polimer olarak kolajen tip I kullanılmıştır. Kolajen doku iskelesi hazırlanmasında kolajen önce liyofilize edilmiş daha sonra dehidrotermal (DHT) muamele ile 100 ºC derecenin üzerinde çapraz bağlanmıştır. Elde edilen gözenekli yapı optimize edilmiş ve daha sonra karakterizasyonu yapılmıştır. Sentetik polimer olarak ise Poli (-L-laktat) (PLLA) kullanılmış olup bu polimerin kullanıldığı iki farklı doku iskelesi hazırlanmıştır. PLLA doku iskeleleri elektroeğirme yöntemi ile hazırlanmıştır. Elektroeğirme yöntemiyle PLLA eğirmesi için gerekli şartlar optimize edilmiştir. Başarılı fiber eldelerinin ardından doku iskelelerinin hazırlanması için iki farklı kolektör kullanılmıştır. Kolektör farklılıkları amaçlandığı gibi yönlenmiş ve örgüsüz PLLA doku iskelesinin elde edilmesini sağlamıştır. Hazırlanan üç doku iskelesinin taramalı elektron mikroskop (SEM) görüntüleme ile yüzey analizleri yapılmış ve polimerlerin Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) ile fonksiyonel grupları tespit edilmiştir. Kornea yapıları için hazırlanan doku iskelelerinin saydamlıklarına bakılmış ve ışık geçirgenlikleri ölçülmüştür. Yapıların bozunma hızları hesaplanmış ve fiber çapı, gözenek boyutu, kalınlık ölçümleri gibi karakterizasyon testleri yapılmıştır. Tezin üçüncü aşaması ise hücre kültürü aşamasıdır. Bu aşamada kimyasal yöntem ile elde edilen deselülerize matriks, kolajenin çapraz bağlanması ile elde edilen doku iskelesi ve elektroeğirme yöntemi ile elde edilen iki (yönlenmiş ve örgüsüz) doku iskelesine, korneadan izole edilen primer hücreler ekilmiştir. Ekim için kullanılan hücreler primer kültür yöntemi ile sığır korneasından elde edilmiş ve çoğaltılmıştır. Farklı yapı ve çaplardaki bu gruplara uygun sayılarda hücre ekilmiş ve 14 günlük süreçte hücre kültüründeki davranışları incelenmiştir. Hücre kültürü çalışmalarında hücre canlılık ve sitotoksisite testleri yapılmıştır. Hücre kültürünün aşamalarında doku iskelelerine SEM analizi yapılmış ve ışık geçirgenliği ölçülmüştür. Dört grup içinde hücre yapışmasında başarı gözlemlenmiş olup hücre çoğalması ve ölü/canlı hücre arasında farklılıklar gözlemlenmiştir. Gruplar arasında hücre kültürü çalışmaları kapsamında yapılan analizlerde kolajen doku iskelesinde başarılı sonuçlar görülmüştür.

The purpose of the thesis was to prepare biocompatible corneal tissue scaffolds from synthetic and polymeric materials. The thesis comprises three studies that are grouped and reviewed in three separate chapters. The first chapter explains the usage of xenograft as a corneal tissue scaffold material. To obtain the xenografts, different methods of decellularization were used, in particular, two different conventional and one relatively new method was used for the process. For the decellularization process a chemical agent, an enzymatic agent and supercritical fluid was used. In these trials, histologic and fluorescent dyes were applied and the results were compared. In the chemical decellularization method, DNA and GAG were quantitatively measured. In the study, it was observed that with supercritical fluid decellularization cells could not be removed under low pressure and heat, however, the chemical and enzymatic methods were able to remove cells. Of the latter two, the chemical method was more successful with the removal of cells, although quantitative analysis revealed that the chemical method was also caused changes to the ECM structure of the tissue. In the second part of the study; tissue scaffolds were developed from synthetic and natural polymers. As a natural polymer, liquid collagen Type 1 was used. In the production of collagen tissue scaffolds, collagen was first lyophilized and then crosslinked with dehydrothermal processing DHT at more than 100°C. The resulting product was first optimized and then characterized. As a synthetic polymer, Poly(L-Lactate) (PLLA) was chosen and used for the construction of two different scaffoldings. PLLA tissue scaffoldings were created with an electrospinning method. Conditons were optimized for the electrospinning. After successful fibers were obtained, two different collectors were utilized to create tissue scaffolds. As expected, each collector yielded different scaffolds, namely, random and aligned PLLA tissue scaffolds. Surface analysis of all three scaffolds was performed via microscopic investigation and their funfctional groups were determined with Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). The transparency and light transmittance of tissue scaffolds prepared as corneal structures was tested. The degradation rate of the structures was calcultated and characterization tests such as fiber, pore and thickness measurements were also performed.The third part of the thesis is composed of the in vitro studies. In this section, the decellularized scaffolds obtained with the chemical method, cross-linked collagen scaffolds and the two different scaffolds obtained via electrospinning were seeded with cells which are derived cornea. The cell were derived from bovine cornea by a primary culture method and reproduced. Each group received a number of cornea cells appropriate to their structure and diameter and their behaviour in cell culture was investigated over 14 days. Cell viability and cytotoxicty analyses were performed throughout the in vitro analysis. SEM and light transmission analyses were also performed at different stages of the in vitro study. Cell attacment success was observed for all four groups and differences in cell proliferation and live/dead cell ratio was determined. The in vitro analyses revealed that the collagen scaffolds were more successful compared to the other scaffolds