Kitosan/biyomimetik bor nano hidroksiapatit doku iskelesinin diş pulpa-dentin kompleksinin rejenerasyonunda kullanılması

Abstract

Sunulan tez çalışmasının amacı, odontoindüktif özelliğe sahip bor katkılı nano hidroksiapatit kaplı kitosan (B-nHAp/kitosan) doku iskeleleri üzerinde insan 20 yaş gömülü dişlerden elde edilen mezenkimal kök hücrelerin in-vitro odontojenik farklılaşma potansiyellerinin incelenmesidir. Tez çalışmasının ilk aşamasında dondurarak-kurutma yöntemiyle 100 μm gözenek çapına sahip kitosan doku iskeleleri hazırlanmıştır. Ardından hazırlanan doku iskeleleri, mekanik ve biyoaktif özelliklerini iyileştirmek amacı ile mikrodalga enerjisi yardımı ile yapay vücut sıvısı (10xSBF) ve bor katkılı yapay vücut sıvısı (B-SBF) kullanılarak sırasıyla nano hidroksiapatit (n-HAp) ve bor katkılı nano hidroksiapatit (B-nHAp) ile kaplanmıştır. Çalışmanın sonraki aşamasında, insan diş pulpasından mezenkimal kök hücre izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Hücre canlılığı MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür) analizi ile, hücre morfolojisi F-aktin/DAPI ve kristal viyole boyamaları ile incelenmiştir. Mezenkimal kök hücrelerin multipotensi özelliklerini incelemek için çalışmalar, büyüme ve farklılaşma ortamı olmak üzere iki farklı koşulda yürütülmüştür. Oil Red O boyaması ile hücrelerde yağ doku farklılaşmasını gösteren hücre içi yağ damlacıkları belirlenmiştir. Osteojenik farklılaşmanın göstergesi olan matris mineralizasyonu alkalin fosfataz-von Kossa (ALP/VK) boyaması ile gösterilmiş ve zamanla mineralize nodüllerin çoğaldığı tespit edilmiştir. Kondrojenik farklılaşma, Safranin O/Fast Green boyaması ile gösterilmiştir. Diş pulpası mezenkimal kök hücrelere özgü yüzey belirteçleri akış sitometrisi analizi ile belirlenmiştir. Böylece, çalışmada kullanılacak insan diş pulpası kök hücrelerinin (iDPKH) karakterizasyonu tamamlanmıştır. Tez çalışmasının son aşamasında, izole edilen mezenkimal kök hücrelerin B-nHAp/kitosan doku iskeleleri üzerindeki üreme ve osteojenik farklılaşmasının incelenmesi için durgun koşullarda in-vitro hücre kültür çalışmaları yürütülmüştür. Doku iskeleleri üzerinde hücre canlılığı ve üremesi Presto Blue analizi, hücrelerin morfolojik özellikleri ise taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile değerlendirilmiştir. Hücrelerin odontojenik farklılaşma belirteçleri olan alkalen fosfataz (ALP), runt-ilişkili transkripsiyon faktörü 2 (RunX2), kollajen-I, osteokalsin (OCN), osteopontin (OP) ve dentin siyalofosfoprotein (DSPP) gen ifadeleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile tespit edilmiştir. iDPKH'ler ile elde edilen sonuçlar bor katkılı nano hidroksiapatit kaplı kitosan doku iskelesinin bu hücrelerin yapışmasını, çoğalmasını ve farklılaşmasını desteklediği yönündedir. Sonuç olarak sunulan tez çalışmasında bor katkılı nHAp'in iDPKH'lerin doku iskeleleri üzerinde üreme ve odontojenik farklılaşma potansiyelini önemli derecede etkilediği ve bor katkılı kitosan doku iskelesinin diş doku mühendisliği uygulamaları için alternatif bir yapı olarak kullanılabileceği düşünülmüştür.

The aim of the presented study is to investigate in-vitro odontogenic potential of mesenchymal stem cells, isolated from dental pulp of the human third molar, on boron doped nano hydroxyapatite coated chitosan (B-nHAp/chitosan) scaffolds with odonto-inductive properties.In the first part of the study, chitosan scaffolds, which have approximately 100 μm pore diameter, were prepared by freeze-drying technique. In order to enhance the mechanical and bioactive properties of the scaffolds, they were coated with nano hydroxy apatite (nHAp) and boron doped nano hydroxy apatite (B-nHAp) through the aid of microwave energy by using 10xSBF (simulated body fluid) and boron containing 10xSBF (B-SBF). In the following part of the study, mesenchymal stem cells were isolated from human third molar dental pulp. The cell viability was evaluated by MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay, cell morphology was investigated by F-actin/DAPI and crystal violet staining. Intracellular fat droplets which show adipogenic differentiation was assessed using Oil Red O staining. Matrix mineralization which shows osteogenic differentiation was visualized by alkaline phosphatase-von Kossa (ALP-VK) staining and it was detected that mineralized nodules were getting increased by time. Differentiation into the chondrogenic lineage was demonstrated by Safranin O/Fast Green staining. In order to further characterize the population, the specific surface markers of human dental pulp stem cells (hDPSCs) were demonstrated by flow cytometry analysis. Thus, isolation and characterization studies of hDPSCs used in this study were completed. In the last part of this study, the proliferation and odonto-inductive differentiation of hDPSCs on chitosan, nHAp/chitosan and B-nHAp/chitosan scaffolds were investigated by in-vitro cell culture studies, under static conditions. Cell viability and proliferation were analyzed by Presto Blue assay and morphological examination was done with scanning electron microscopy (SEM). Odontogenic differentiation markers, alkaline phosphatase, collagen type I, runt related transcription factor 2 (RunX2), osteocalcin (OCN), osteopontin (OPN) and dentin sialophosphoprotein (DSPP) expression levels of the cells were determined using real time polymerase chain reaction (RT-PCR). The results showed that boron doped nano HAp coated chitosan scaffolds supported adhesion, proliferation and differentiation of hDPSCs.