Biyomedikal uygulamalar için çok-işlevli demir oksit-gadolinyum borat kompozit nanoplatformların geliştirilmesi

Abstract

Bu doktora çalışmasının ilk bölümünde, basit ve biyouyumlu inorganik kimyasallar kullanılarak ve bir hidrotermal yolla Fe3O4-GdBO3 nanokompozitleri hazırlandı. Bor kaynağı olarak boraks (BX) ve borik asit (BA), demir oksit olarak kaplanmamış ve PEG-lenmiş (polietilen glikol) magnetit (Fe3O4) ve Gd(III) kaynağı olarak Gd(NO3)3.6H2O kullanıldı. Elde edilen kompozitlerin özelliklerini metodoloji ile ilişkilendirmek amacıyla deneysel koşullar sistematik olarak değiştirildi. Fe3O4 üzerine GdBO3 kaplanmasıyla elde edilen ürünler X-Işını Kırınımı (XRD), Fourier Dönüşümlü İnfrared Spektroskopisi (FT-IR),Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM), Enerji Dispersif X- Işını Spektroskopisi (EDS), Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM), Termogravimetrik Analiz (TGA) ve manyetizasyon ölçümleri ile karakterize edildi. Toz XRD desenleri, Fe3O4 ve GdBO3 yansımaları ile örtüşen iki-fazlı kompozitlerin oluştuğunu gösterdi. BX veya BA kullanımı, kaplanmamış veya PEGkaplanmış Fe3O4 kullanımı, reaktantların mol oranının değiştirilmesi ve pH gibi deneyselparametrelerin kaplanan borat yapısını, boyutunu, nanokompozit morfolojisini ve doyummanyetizasyon değerini etkilediği görüldü. Bor kaynağı olarak BA kullanıldığında vaterittipi [Gd3(B3O9)], BX kullanıldığında ise triklinik GdBO3 içeren ve Gd/B mol oranı 1:1 olan borat fazları oluştu. Daha küçük ve düzgün kompozit yapılar elde etmek için PEG kaplıFe3O4 nanoparçacıklarının daha elverişli bir destek malzemesi olduğu anlaşıldı. BX ilehazırlanan nanokompozitlerin TEM görüntülerinde; 20-40 nm büyüklüğünde magnetitnanoparçacıklarının gadolinyum borat bulutu ile çevrelendiği, BA ile hazırlanannanokompozitlerin ise 100-150 nm boyutunda kübik şekilde parçacıklardan oluştuğuanlaşıldı. Hazırlanan Fe3O4-GdBO3 nanokompozitlerin hepsi, biyoteknoloji ve tıpuygulamaları için uygun olabilecek yumuşak ferromanyetik özellikler sergiledi. Uygulananhidrotermal sentez tekniği; basitlik, verimlilik ve deney koşullarının ayarlanmasıylakontrollü nanokompozit yapılarının hazırlanmasına izin veren avantajlı bir yöntem olarakdeğerlendirildi.İkinci bölüm, Fe3O4-GdBO3 nanokompozitlerinin biyo-işlevlendirilmesini içermektedir.Biyo-konjugasyon işlemi (i) sitrik asit (CA) ve (ii) Floresein izotiyosiyanat katkılanmışsilika (FITC-SiO2) ve ardından folik asit (FA) ile gerçekleştirildi. Çeşitli nitel ve nicel analizteknikleriyle (X-Işını Fotoelektron Spektroskopisi / XPS, SEM, TEM, İndüktif EşleşmişPlazma-Optik Emisyon Spektroskopisi / ICP-OES) nanokompozitlerin başarılı bir şekildeişlevlendirildiği gösterildi. Hepsinin biyolojik uygulamalar için uygun yumuşakferrromanyetik özelliğe ve zeta potansiyeline sahip olduğu bulundu. Biyokonjugenanokompozitlerdeki ortalama 10B ve 157Gd içerikleri 1014 atom/μg olarak hesaplandı veGd/Fe mol oranlarının da 0.27-0.63 arasında değiştiği bulundu. Bu değerler; Fe3O4-GdBO3nanokompozitlerinin BNCT, GdNCT ve kombine GdBNCT uygulamalarındakullanılabileceğini ve Gd/Fe oranının ayarlanabilir olması ile aynı zamanda multi-modalMRI (T1, T+T2) ajanı olarak da kullanılabileceklerini gösterdi.Son olarak; bu parçacıkların biyouyumluluğu ve NCT/MRI uygulamalarındaki olasıkullanılabilirliğini incelemek için, in vitro hücre çalışmaları yapıldı. MIA-Pa-CA-2hücreleriyle yapılan akış sitometre çalışmaları, nanokompozit parçacıklarının doza bağlıolarak kanserli hücreler tarafından alımının arttığını gösterdi. Nokta-alan analizleri, 10μg/mL konsantrasyondaki nanokompozit örnekleri ile inkübasyon sonucunda tümparçacıkların hücre içine girdiğini; 1 μg/mL konsantrasyon ile floresans gözlenmeyebaşladığını ve 10 μg/mL ile inkübasyon sonucunda oldukça net floresans görüntülemeyapıldığını gösterdi. 1015 tane 10B ve 157Gd atomu içeren 10 g FA-konjuge nanokompozitörneğinin 0.125x106 tane kanser hücresiyle etkileştiği, bu değerin BNCT ve GdNCT için istenen değerin on kat fazlası olduğu ve aynı zamanda GdBNCT için de uygun bir Gd/10Boranının sağlandığı anlaşıldı.Bu çalışmada hazırlanan yeni nesil biyo-işlevlendirilmiş Fe3O4–GdBO3 kompozitnanoplatformlarının, `manyetik hedefli tedavi, floresan görüntüleme, manyetik rezonansgörüntüleme, nötron yakalama tedavisi` gibi potansiyel teranostik uygulamalar için uygunkapasitede oldukları gösterilmiştir.

In the first part of this PhD study, Fe3O4-GdBO3 nanocomposites were prepared via ahydrothermal route using simple and biocompatible inorganic chemicals. Borax (BX) andboric acid (BA) were used as the boron precursors; plain and PEGylated magnetite wereused as the source precursors for Fe3O4 and Gd(NO3)3.6H2O as the source of Gd(III). Theexperimental conditions were systematically varied to link the properties of the finalcomposites with the methodology. The products obtained by depositing gadolinium borateover magnetite were analyzed by powder X-Ray Diffraction (XRD), Fourier TransformInfrared Spectroscopy (FT-IR), Scanning Electron Microscopy (SEM), Energy DispersiveX-Ray Spectroscopy (EDS), Transmission Electron Microscopy (TEM), ThermogravimetricAnalysis (TGA) and magnetization measurements. The XRD patterns of the nanocompositesshowed a bi-phase pattern with reflections matching with those of Fe3O4 and GdBO3. Theresults showed that the experimental parameters e.g. using either BX or BA, uncoated- orpolyethylene glycol (PEG) coated-Fe3O4 as the precursors, changing reactant concentrationsand the pH, all influence the structure of the borate coating, coverage type, size andmorphology of the nanocomposites and saturation magnetization values to some extent. Thecoating was yielded in the form of vaterite-type orthoborate [Gd3(B3O9)] with BA and triclinic-GdBO3 with BX, both having the Gd/B ratio of 1/1. PEGylated Fe3O4 appeared tobe a preferable support for coating with the borate layer to obtain smaller size and uniformcomposite structures. The composites prepared with BX displayed typical TEM imageswhere a bunch of spherical 20-40 nm size magnetite nanoparticles were surrounded with agadolinium borate cloud while nearly cubic, pseudo core-shell nanocomposite particles of100-150 nm size were obtained with BA at pH 9. The prepared Fe3O4-GdBO3nanocomposites all displayed soft ferromagnetic properties that might be relevant forapplications in biotechnology and medicine. Hydrothermal synthesis offered the advantagesof simplicity, efficiency and allowed for the preparation of controlled nanocompositestructures by carefully tuning the experimental conditions.The second part of this study involves the bioconjugation of GdBO3-Fe3O4 nanocomposites.The bioconjugation processes were performed with citric acid (CA) andfloresceinisothiocyanate-doped silica (FITC-SiO2), followed by the treatment with folic acid(FA). The successful functionalization of the nanocomposite particles was demonstrated byqualitative and quantitative (X-Ray Photoelectron Spectroscopy/XPS, SEM, TEM,Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectroscopy/ICP-OES) analytical data. Allbioconjugates displayed soft ferromagnetic properties and zeta potential values that areappropriate for biological applications. The 10B and 157Gd contents were ca. 1014 atom/gmaking them promising agents for Boron Neutron Capture Therapy (BNCT), GadoliniumNeutron Capture Therapy (GdNCT) and the combined GdBNCT. The Gd/Fe molar ratios(0.27-0.63) provided capability for T1- or dual (T1+T2) magnetic resonance imaging (MRI).Finally, to examine the biocompatibility and possible applicability of these particles for NCTand MRI imaging, in vitro tests were performed. Flow cytometry results with MIA-Pa-CA-2 cells demonstrated that there is a dose-dependent increase in cellular uptake of allnanocomposites. The dot-plot analysis of MIA-PaCA-2 cells showed that all nanocompositeparticles penetrated into MIA-Pa-CA-2 cells after incubation at 10 μg/mL. The cells beganto show fluorescence intensity after incubated with 1 μg/mL concentration and the greendots due to FITC were clearly observed at the 10 μg/mL incubation. Overall, a 10g of FAconjugatednanocomposite containing 1015 atoms of 10B and 157Gd was found effective for0.125x106 cancer cells making 1010 atoms per cell. The boron and gadolinium contentsexceed the required concentrations to sustain a neutron capture reaction for BNCT andGdNCT by tenfold also providing an appropriate Gd/10B ratio for GdBNCT. The bioconjugated nanoplatforms of GdBO3-Fe3O4 composites, introduced herein, provedto have potential features of next generation agents for theranostic applications like`magnetically targeted therapy, fluorescence imaging, magnetic resonanceimaging/diagnosis and neutron capture therapy`.