Tricholoma anatolicum H. H. Doğan & Intini`un HEPG2 hücreleri üzerinde H2O2 kaynaklı hasara karşı hepatoprotektif etkilerin belirlenmesi

Abstract

Yüzyıllar boyunca insanlar mantarları besin olarak tüketirken aynı zamanda hastalıkların tedavilerinde de kullanmaktadırlar. Makrofunguslar 21. yüzyılda birçok interdisipliner alanda farklı araştırmalara kaynak olmakta ve tedavi amaçlı çalışmalar için kullanılmaktadır. Yenen ve yenmeyen mantar türlerinin birçoğu önemli tıbbi çalışmalarda kullanılarak elde edilen etkileri, hastalıkların iyileştirilmesinde kullanılmaya başlanmıştır. Türkiye'de endemik bir mantar türü olan Tricholoma anatolicum un HEPG2 karaciğer kanser hücre hattı üzerinde hidrojen peroksit(H2O2) kaynaklı oluşturulan oksidatif strese karşı hepatoprotektif etkileri araştırılmıştır.Çalışmada Tricholoma anatolicum ultrasonikasyon ve fraksiyon yöntemleri sonucunda ekstrakte edilmiştir. Elde edilen ekstraktların HEPG2 karaciğer kanser hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkileri araştırılıp hepatoprotektif etkileri belirlenmiştir. Tricholoma anatolicum sulu ekstraktının(EHTA) farkılı konsantrasyonları 24-48-72 saat HEPG2 hücrelerinin hücresel morfolojilerine ve yaşam döngüsüne etkileri TBE (Trifan boyası dışlama), XTT ve gerçek zamanlı hücre analizi (Xcelligence cihazıyla) yöntemleriyle belirlenmiştir. EHTA ekstraktının HEPG2 hücreleri üzerindeki TBE hücre canlılığı analizinde, 1-5 µg/ml konsantrasyonlarının hücrede koruyucu etki gösterdiğini ancak artan konsantrasyonlarda sitotoksik etki gösterdiği belirlenmiştir. XTT sitotoksisite analizine göre EHTA ekstraktının 24 saat IC50 değeri > 2000 µg/ml, 72 saat IC50 değeri 1525 µg/ml olarak belirlenmiştir. Xcelligence cihazında yapılan gerçek zamanlı hücre analizinde EHTA ekstraktının 24 saat IC50 değeri 241,539 µg/ml, 48 saat IC50 değeri 418,135 µg/ml ve 72 saat IC50 değeri 285,694 µg/ml olarak belirlenmiştir. EHTA ekstraktının HEPG2 hücreleri üzerinde hücre yolağı (apoptoz ve nekroz) etkileri Annexin-V-apc ve 7AAD floresan boyaları yardımıyla akım sitometri yöntemiyle (flow sitometri) belirlenmiştir. EHTA ekstraktının artan konsantrasyonlarda HEPG2 hücrelerini apoptoza yönlendirdiği belirlenmiştir. Son olarak EHTA ekstraktında bulunan fenolik bileşikler DPPH metodu ve yüksek performanslı sıvı kromotografisi (HPLC) ile belirlenmiştir. Analiz sonuçlarına göre DPPH metodu analizinde EHTA ekstraktı 25.000 µg/ml iken, FHTA ve FETA ekstraktları > 25.000 µg/ml olarak belirlenmiştir. HPLC analizinde 100 g numunede 100 mg referans noktasına göre EHTA ekstraktında kateşin ve vanilik asit pik vermiş, FHTA ekstraktında kateşin pik vermiş ve FETA ekstraktı ise pik vermemiştir. Araştırma sonuçlarına göre T. anatolicum mantarının düşük dozlarda HEPG2 hücreleri üzerinde sitostatik etkisi, yüksek dozlarda ise sitotoksik etkisi belirlenmiştir.

People have been using mushrooms in the treatment of diseases as well as food, for centuries. In the 21st century, macrofungi is used in various interdisciplinary fields as a source for researches including therapeutic based researches. Most of the edible and inedible mushroom species were used in important medical studies and their effects were begun to be used in the treatment of diseases. This study focuses on the hepatoprotective effects of Tricholoma anatolicum, which is endemic specie in Turkey, against oxidative stress based on hydrogen peroxide (H2O2) on HEPG2 liver cancer cell line. T. anatolicum used in this study was extracted with the help of ultrasonication and fraction methods. Then the cytotoxic effects of extracts on HEPG2 liver cancer cell line were explored and their hepatoprotective effects were determined. Moreover, various concentrations of aqueous extract (EHTA) of T. anatolicum were determined by HEPG2 cells's 24-48-72 hours effect analysis on their cellular morphology and life cycle, TBE (Triphan Blue Exclusion), XTT and real-time cell analysis in of Xcelligence device. Within the EHTA extract's TBE cell viability analysis on HEPG2 cells, it was determined that 1-5µg/ml concentrations were to show protective effect in the cell, while there found to be cytotoxic effect in increasing concentrations. According to XTT cytotoxicity analysis, the EHTA extract values were determined as follows: 24h IC50 > 2000 µg/ml, 72 hours IC50. Furthermore, according to the real-time cell analysis made with Xcelligence device, EHTA extracts were found to be; 24h IC50 = 241.539µg/ml, 48 h IC50 = 418.135µg/ml, 72 h IC50 = 285.694µg/ml. EHTA extract's cell pathway (apoptosis and necrosis) effects on HEPG2 cells were determined with flow cytometry method with the help of Annexin V-APC and 7AAD fluorescent dye. Increasing concentrations of EHTA extracts were determined to direct HEPG2 cells to apoptosis. Finally, the phenolic compounds found in EHTA extracts were determined with the help of DPPH and high performance liquid chromatography (HPLC) methods. According to the results of the analysis, while EHTA extract was determined to be 25,000µg/ml in DPPH method analysis, FHTA and FETA extracts were found to be > 25,000µg/ ml. Moreover, considering the HPLC analysis –according to the reference point of 100mg in 100g sample– within EHTA extracts, catechins and vanillic acid peaked, within FHTA extracts catechins peaked and there was no peak within FETA extracts. The final results revealed that T.anatolicum's effect on HEPG2 was cytostatic at low doses, and cytotoxic at high doses.