Koyunlardaki sarcocystis türlerinin RAPD-PCR fingerprinting ile teşhisi

Abstract

6. ÖZET S.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü Parazitoloji (Vet) Ânabilim Dalı DOKTORA TEZİ / KONYA 2001 Osman Selçuk ALDEMİR Koyunlardaki Sarcocystis Türlerinin RAPD-PCR Fingerprinting ile Teşhisi Bu çalışmada, koyunlarda görülen Sarcocystis türlerinin ve yaygınlıklarının belirlenmesi ile moleküler biyolojilerinin araştırılması amacıyla Random Amplified Polymorphic DNA Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RAPD-PCR) Fingerprinting tekniği kullanılmıştır. Tür identifikasyonu amacı ile S. gigantae için makroskobik ve mikroskobik kistlerden, S. arieticanis ve & tenella için mikroskobik kistlerden yararlanılmıştır. DNA ekstraksiyonu için Fenol ekstraksiyon etanol prespitasyon metodu uygulanmıştır. Ayrıca, çalışmada Tripsin tekniği de uygulanarak, iki metodun sonuçları karşılaştırılmıştır. Makroskobik incelemeler sonucu 130 koyunun 19 (% 14.61)'unda Sarcocystis spp. makrokistleri tespit edilmiştir. Makroskobik kist tespit edilmeyen 111 özefagus örneğinin 88 (% 79.28)'inde mikroskobik kist saptanmıştır. Muayene edilen 111 özefagusun 55 (% 49.55) 'inde S tenella, 25 (% 22.52) 'inde £ arieticanis ve 8 (% 7.2 l)'inde S gigantae tesbit edilmiştir. Random Amplified Polymorphic DNA Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RAPD- PCR) Fingerprinting ile, makroskobik kist tespit edilmeyen 1 1 1 adet özefagus örneğinin 109 (% 98.20) 'unda Sarcocystis spp. mikroskobik kistleri tespit edilmiştir. Bu mikrokistlerin 68 (% 61.26) 'inin S. tenella, 39 (% 35.14) 'unun S. arieticanis ve 2 (% 1.80) 'sinin S gigantae' ye ait oldukları tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre; RAPD-PCR fingerprinting tekniğinin tripsin tekniğine oranla daha duyarlı ve özgül olduğu 44belirlenmiştir. Koyunlardaki Sarcocystis türlerinin DNA' sini amplifıye etmek için farklı sekansa sahip üç primer (OSA-01 : 5'-CCAAGCTTCC-3/ OSA-02 : 5'-GGAAGCTTGG-3' ve OSA-03 : 5'-CCAGTACTCC-3') seçilmiştir. Random Amplified Polymorphic DNA Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RAPD-PCR) Fingerprinting ile amplifiye edilen band sayıları ve katsayılar sayesinde genetik ilişkinin değerlendirilmesi ile patojenik türlerin (S. tenella, ve S. arieticanis), ayrı bir küme oluşturan S. gigantea' dan açık bir şekilde ayrıldığı tesbit edilmiştir. Sonuç olarak; Sarcocystis türlerinin Konya yöresi koyunlarında çok yaygm ve S. tenella' nm dominant tür olduğu belirlenmiş, RAPD-PCR fingerprinting tekniğinin teşhis açısından tripsin tekniğinden daha duyarlı ve özgül olduğu saptanmıştır. 45

7.SUMMARY Diagnosis Of Ovine Sarcocystis Species by Random Amplified Polymorphic DNA - Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) Fingerprinting In this study, the RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA-PCR) technique was used to investigate the presence and prevalence of the ovine Sarcocystis spp. and their molecular biology. In order to identification of parasite, macroscopical and microscopical cysts were used for S. gigantea and S. arieticanis or S.tenella. Phenol extraction/ethanol precipitation method was employed to obtain parasitic DNA. In addition, the molecular based technique was compared with the conventional trypsin technique. By macroscopically examinations of a total number of 130 sheep, 19 (14.61 %) were determined to be infected with Sarcocystis macrocysts. Of the remaining a number of 111 oesophagus samples in which 88 (79.28 %) macroscopically cysts were determined that consisted of those non-infected with macrocysts, 55 (49.55 %) were found to be infected with S. tenella. In the remaining, corresponding values for the other Sarcocystis species were as follows: 25 (22.52 %) and 8 (7.21 %) for S. arieticanis and S. gigantae, respectively. RAPD-PCR was able to detect Sarcocystis ssp. in the 109 (98.20%) of the 111 oesophagus sample in which macroscopically cysts were previously not observed. Of these cysts, 68 (61.26 %) S tenella, 39 (35.14 %) S.arieticanis and 2 (1.80 %) S gigantae were identified. This study revealed that RAPD-PCR is more susceptible and specific than the trypsin technique on the detection of Sarcocystis spp. from tissue. 46After optimisation of the PCR conditions, three primers (OSA-01 : 5'- CCAAGCTTCC-3', OSA-02 : 5'-GGAAGCTTGG-3' ve OSA-03 : 5'- CCAGTACTCC-3') were selected to amplify DNA of the three parasite species. By generating band patterns with RAPD-PCR, it was possible to estimate the genetic relatedness among species in question. Pathogenic Sarcocystis spp., S. tenella and S. arieticanis are grouped together and are clearly distinct from S. gigantea, which form a separate cluster. As a result, Sarcocystosis is very common and the species S. tenella is the dominant one in sheep in the Konya Province. It was also determined that RAPD-PCR fingerprinting technique was more specific and sensitive than trypsin technique. 47