Malondialdehit tayinine yönelik biyosensör tasarlanması ve mevcut analiz yöntemleri ile karşılaştırılması

Abstract

Endoperoksitlerin kaynağını oluşturan ve oksidatif hasarın bir belirteci olan Malondialdehitin mevcut analitik yöntemleriyle yapılan ölçümlerinde, yöntem performansına bağlı sınırlılıklar bulunmaktadır. Bu tez çalışmasında; daha hızlı sonuç verebilen, daha hasssas, maliyeti düşük yeni bir analiz yönteminin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu hedefle, MDA tayinine yönelik sensör tasarımında şu ana kadar denenmemiş olan bir yöntem izlenmesi ve MDA tayininde metot validasyonunun temelinin oluşturulması amaçlanmıştır. Mevcut kolorimetrik ve HPLC metotlarının verileri ile tasarladığımız elektrokimyasal sensörün verileri karşılaştırılarak yöntem performanslarının değerlendirilmesi planlanmıştır. Çalışma, iki aşamalı olarak tasarlanmış ve çalışmanın ilk basamağında MWCNT, grafen, Au ile GC elektrot yüzeylerinin modifikasyonu sonucu modifiye elektrot yüzeyleri hazırlanmıştır. Hazırlanan modifiye elektrot yüzeylerinin karakterizasyonu redoks problar varlığında dönüşümlü voltametri ve elektrokimyasal impedans spektroskopisi tekniklerinin yanı sıra Taramalı Elektron Mikroskobu, Atomik Kuvvet Mikroskobu ve Temas Açısı Ölçümü teknikleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar, yalın GC elektrot yüzeyine ait verilerle karşılaştırılmıştır. Çeşitli nano yapılarla modifiye edilerek yeni bir morfoloji kazandırılmış elektrot yüzeylerinin MDA sensör olarak uygulanabilirliği araştırılmıştır. Optimum yüzey altın modifiye camsı karbon elektrot olarak belirlendikten sonra bu yüzey için kararlılık, tekrarlanabilirlik, tekrar üretilebilirlik, seçicilik ve hasta numunelerine uygulanabilirlik çalışmaları yapılmıştır. Çalışmanın ikinci basamağında ise, MDA tayininde kullanılan elektrokimyasal sensör yöntemi ile HPLC ve kolorimetrik metotlarla elde edilen veriler karşılaştırılmıştır. Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Laboratuvarında oluşturulan hasta plazma havuzunda yapılan çalışmalarla, metotların performans standartlarını değerlendirebilmek amacıyla yöntemin geçerlilik standartlarının hesaplamaları yapılmıştır. Analitik doğruluk, duyarlılık, tekrarlanabilirlilik, interferans, linearite, geri kazanım, don-çöz etkisi gibi birçok açıdan yöntem performansının değerlendirilmesi yapıldığında, gerek HPLC metodu ve gerekse tasarladığımız biyosensör metodunun verilerinin, TBARS metoduna göre daha üstün ve kabul edilebilir düzeyde olduğu tespit edilmiştir. HPLC metoduna ait CV değerlerimiz %4,41-%30,97, biyosensörde bu değerler %4,08-%0,08 aralığında, biyosensöre ait %R değerleri %100,33-%114,59, HPLC'de %94,0-%101,5aralığında olduğu görülmüştür. Lipemik, ikterik, don-çöz etkileri gibi numune kaynaklı faktörlerin biyosensör metodu ile alınan ölçüm sonuçlarına etkisi TBARS metodu ile karşılaştırıldığında oldukça düşüktür. Hemolizli numunenin MDA düzeylerine olan etkisi biyosensörde daha yüksek bulunmuştur. Dolayısıyla biyosensörlerle MDA ölçüm analizlerinde hemolizli numune kullanılmaması sonucuna varılmıştır. Bununla birlikte, biyosensör metodunun kolay uygulanabilir olması, yüksek konsantrasyonlarda da linearite göstermesi, CV ve geri elde değerlerinin kabul edilebilir düzeyde olması bakımından HPLC metoduna göre avantaj sağladığı kanaatine varılmıştır.Anahtar Kelimeler: Altın nanopartikül; Biyosensör; HPLC; Malondialdehit; TBARS

Malondialdehyde (MDA) is a source of endoperoxides and marker of oxidative damage. In analysis of MDA, have limitations in the performance of the current analytical methods. In this thesis study, it was planned to develop a new analytical method that is much faster, more accurate and lower cost process. With this target, it was aimed to pursue a method that has not been tried so far in sensor design and to establish the basis of method validation in MDA determination. It is planned to evaluate the method performance by comparing the data of the designed electrochemical sensor with the current methods of HPLC and colorimetric.The study was designed in two stages and in the first step of study, modified electrode surfaces was prepared with the modification of MWCNT, graphene, Au of glassy carbon electrode surfaces.The characterization of the prepared electrode surfaces was realized using of techniques cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy in the presence of redox probes, as well as scanning electron Microscopy, Atomic Force Microscopy and Contact Angle Measurement techniques. The electrode surfaces which is modified with various nano structures and thus a new morphology has been investigated as an MDA sensor. The results obtained, was compared those given for bare glassy carbon electrode surfaces. After the optimum surface has been identified as a gold modified glassy carbon electrode, stability, reproducibility, repeatability, selectivity and applicability to patient samples was studied according to analytical performance criteria for this surface.In the second step of the study, data of the electrochemical sensor's were compared with methodological data of HPLC and colorimetric, which are used in the determination of MDA. The validity standards of the method calculated with the studies done in patients' blood pool that were provided from Selcuk Univesity Department of Biochemistry Laboratories, in evaluating the performance standards of the methods. In evaluation of the performance of the methods according to analytical accuracy, sensitivity, recovery, interference, linearity, freeze-thaw effect, the HPLC and biosensor methods that are designed, are superior to the TBARS method and are in acceptable level. The CV levels were %4,41-%30,97 in HPLC method and %4,08-%0,08 in biosensor. Recovery levels were respectively %100,33-%114,59 and %94,0-%101,5 in biosensor and HPLC methods. Sample property factors such as lipemic, icteric samples, of freeze-thraw effects were more less in biosensor's data than the data of TBARS. The interference of the hemolysis on MDA level was higher in biosensor method. Therefore, we concluded not to analyze MDA level sin hemolysis samples. Likewise, the biosensor method is easy in applying procedure and has linearity in high concentrations, acceptable recovery levels. These findings show that biosensor method has an advantageous over the HPLC method.Keywords: Biosensor, Gold nanoparticle, HPLC, Malondialdehyde, TBARS