Köpek mezenkimal kök hücrelerinin in-vitro nörojenik farklılaştırılması ve özelliklerinin incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada köpek kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin izolasyonu, kültürü, karakterizasyonu ve in-vitro ortamda nörojenik nesile farklılaştırılması incelenmiştir. Köpeğin iliak krestinden toplanan köpek kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (Kİ-MKH) hücre kültürü ortamında çoğaltıldı. Çoğaltılan hücrelerin karakterizasyonu için koloni oluşturma potansiyelleri, empedansa dayalı hücre analiz sistemi ile hücre büyüme eğrisi, çoklu soy ve akım sitometri analizleri gerçekleştirildi. Bu aşamadan sonra köpek Kİ-MKH'leri, geliştirilen iki-aşamalı nörojenik farklılaştırma protokolüne tâbi tutuldu. Nöroküre oluşturmak amacıyla yapılan ilk indüksiyon aşamasında hücreler; epidermal büyüme faktörü (EGF) ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) içeren nörobazal vasatta kültüre alındı. Üç gün süren ilk indüksiyon aşamasından sonra elde edilen nöroküreler ışık mikroskobunda görüntülendi. Nöroküre oluşum aşamasından sonra nörojenik farklılaşmanın ikinci basamağı olan nöron-benzeri hücre oluşum aşamasına geçildi. Dağıtılan nöroküreler, sinir büyüme faktörü (NGF), beyin-kaynaklı nörotrofik faktörü (BDNF) içeren nörobazal vasatta altı gün kültüre alındı. İkinci indüksiyon aşaması sonunda nörojenik nesile farklılaştırılmış köpek Kİ-MKH'lerinin immunhistokimya boyamaları yapıldı. İn-vitro ortamda, köpek kemik iliğinden izole edilen hücrelerin mezenkimal karakterde olduğu, nöronal ve glial işaretçileri ifade eden hücrelere farklılaşabildiği ve bu hücrelerin ise gelecekte sinir doku hasarlarının tedavisinde fonksiyonel yenilenme için kullanılabilme potansiyeline sahip olduğu gözlendi.

In this study, we have investigated the mesenchymal properties and neurogenic differentiation potentials of cultured canine bone marrow stem cells. Canine mesenchymal stem cells isolated from the iliac crest of canine were proliferated under sterile conditions. The mesenchymal properties of the cultured cells were confirmed using coloniy forming unit, impedance-based cell analysis system, lineage and flow cytometry analysis. At passage 2; BM-MSCs were induced into the neurogenic lineage by a two-step differentiation protocol. Cells were placed in tissue culture flasks coated with poly(hydroxyethylmethacrylate) and cultured in the B-27 and N-2 containing neurobasal medium. At the second step, the acquired neurospheres were disaggregated and the cell suspension was plated in tissue culture flasks which were coated with poly-L-ornithine. The neurosphere-derived cell suspension was then cultured for six days in the neurobasal medium supplemented with nerve growth factor (NGF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) for further induction into the neurogenic lineage. For determination of neurogenic differentiation of the mesenchymal stem cells, primary antibodies were used. The findings indicated that mesenchymal stem cells differentiate into cells expressing neuronal and glial markers in vitro and some mesenchymal stem cells exhibit neural potential.