Recombinant phage endolysins production and investigation of their efficacy against staphylococcal biofilms

Abstract

Patojen bakteriler arasında antibiyotik direncinin giderek yayılması ve biyofilm enfeksiyonları ile etkin bir mücadele için günümüzde alternatif antimikrobiyal ve antibiyofilm özellik gösteren ajanların keşfedilmesine yönelik yapılan çalışmalar giderek önem kazanmıştır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bakteriyofaj kaynaklı endolizinlerin, bakterilerin hücre duvarı yıkımına neden olmaları ile antibakteriyel ajan olarak kullanılma potansiyellerinin olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada, Staphylococcus aureus'u enfekte eden bakteriyofajların izole edilmesi ve bunların endolizin genlerinin rekombinant olarak üretilmesi ve daha sonra stafilokokal biofilmlere karşı etkinliklerinin test edilmesi amaçlandı. Klinik S. aureus suşlarından mitomisin C indüklemesiyle yedi lizojenik faj izole edildi. Konak spektrum aralığı en geniş olan üç faj (Фtrsa10, Фtrsa14 ve Фtrsa15) seçilerek karakterize edildi. Bu üç faj ve ilave olarak ticari S. aureus subsp. aureus 52 fajının endolizin kodlayan gen bölgeleri amplifiye edilerek pET SUMO ekspresyon vektörüne klonlandı. Molekül ağırlıkları 66.22 kD olarak tespit edilen bu dört rekombinant enzim LysSA10, LysSA14, LysSA15 ve LysSA52 olarak adlandırıldı ve E. coli BL21 (DE3) suşunda ekspresse edilerek anti-stafilokok ve anti-biyofilm özellikleri açısından karakterize edildi. Dört endolizin kombine edildiğinde tedavi edici etkilerinin, tek tek uygulanmasına göre daha fazla olduğu ve bunların S. aureus, S. epidermidis, S. heamolyticus de dahil olmak üzere toplam 88 planktonik stafilokokal suşun 78 (% 88,6)'ine karşı aktivite gösterdiği belirlendi. Kateter üzerinde oluşturulan S. aureus ve S. epidermidis biyofilmlerine dört endolizin kombinasyonu eklendiğinde biyofilmdeki hücre popülasyonunda 2.6 log değerinde azalma olduğu, katater endolizin kombinasyonu ile kaplandığında biyofilm inhibisyonunun 1.5 log oranında gerçekleştiği tespit edildi. Bu azalma taramalı elektron mikroskobu ile gösterildi. Sonuç olarak yeni tanımlanan endolizinlerin stafilokokların planktonik ve biyofilm formlarına karşı, özellikle kombine halinde kullanıldıklarında, geniş spektrumda litik aktiviteye sahip oldukları gösterildi. Bu sonuçlar, endolizin enzimlerinin stafilokokal kaynaklı enfeksiyonlarla mücadelede kullanılmak için umut verici bir antibakteriyel ajan olduğunu göstermektedir.

Due to increasing antibiotic resistance among pathogenic bacteria, and inefficient strategies to combat biofilm infections, rigorous search for new alternative antimicrobial and anti-biofilm agents are subjects of many recent studies. Recently, phage endolysins have been investigated as potential antimicrobial agents that kill the cells by disrupting the bacterial cell wall. The present study aimed to isolate bacteriophages that infect Staphylococcus aureus and to express their endolysin genes as recombinant enzymes and then test their efficacy in killing and removal of Staphylococcus biofilms. Seven lysogenic phages were isolated from clinical isolates of S. aureus using the mitomycin C induction. Three phages with widest host range including Фtrsa10, Фtrsa14, and Фtrsa15, were selected and further characterized. From the genomic DNA of these three phages and one commercial phage, S. aureus subsp. aureus bacteriophage 52, the endolysin genes were amplified and cloned into pET SUMO expression vector. Four cloned endolysins, LysSA10, LysSA14, LysSA15, and LysSA52, with a molecular mass of 66 kDa were over-expressed in E.coli BL21 (DE3) and characterized in terms of their anti-staphylococcal and anti-biofilm properties. The therapeutic effects of the four endolysins in combination were significantly superior to that of the individual ones and they showed activity against 78 (88.6 %) of the 88 total planktonic Staphylococcal strains including S. aureus, S. epidermidis, and S. heamolyticus. For S. aureus and S. epidermidis biofilms established on catheters, the addition of endolysin cocktail resulted in up to 2.6 log reduction and coating of catheters with these enzymes resulted in inhibition of biofilm by 1.5 log units. Disruption of biofilms was confirmed further by scanning electron microscope. Overall, the newly identified endolysins exhibited a broad host range, especially in combination, against staphylococcal strains both as planktonic and biofilm forms. Thus, these endolysins are promising antimicrobial agents for combating staphylococcal infections.