Acinetobacter baumannii izolatlarında biyofilm üretimi ve kolistin duyarlılıklarının biyofilm formasyonunda araştırılması

Abstract

Bu çalışmada çeşitli klinik örneklerden izole edilen Acinetobacter baumannii izolatlarının biyofilm oluşturma oranları, biyofilm üretimi tespitinde kullanılan yöntemler ve kolistinin biyofilm üzerine etkinliğinin araştırılması amaçlandı.Çalışma kapsamına çeşitli klinik örneklerden soyutlanan 152 A. baumannii izolatı dahil edildi. Çalışmada biyofilm üretiminin tespitinde tüp yöntemi ve mikrotitrasyon plak yöntemi karşılaştırılmıştır. Tüp yüzeyinde bir film tabakasının oluşması pozitif reaksiyon olarak kabul edildi ve kalitatif olarak değerlendirmeler sonrası 152 A. baumannii suşunun 83'ünde (%54.6) biyofilm oluşumu negatif bulunurken, 69'unda (%45.4) biyofilm oluşumu pozitif bulundu. Mikrotitrasyon yöntemiyle kristal viyole kullanılarak yapılan absorbans ölçümlerine dayanan kantitatif değerlendirme sonucunda 75'inde (%49,3) biyofilm negatif, 68'inde (%44,7) orta derece biyofilm üretimi ve 9'unda (%5,9) güçlü biyofilm üretimi belirlendi. Mikrotitrasyon plağı yöntemi ile tüp yöntemi biyofilm üretimi tespit etme yönünden karşılaştırıldığında uyumlu bulundu (p<0.001). Mikrotitrasyon plağı yöntemi ile biyofilm üretimi pozitif tespit edilen 77 izolatla çalışmaya devam edildi. Kolistinin biyofilm oluşturmuş A. baumannii izolatlarına etkileri 96 kuyucuklu mikrotitrasyon plağı kullanılarak belirlendi. Bir gece önceden oluşturulmuş biyofilme farklı konsantrasyonlarda antibiyotik eklenerek ELISA reader'da optik dansiteleri (OD) ölçüldü. İstatiksel olarak antibiyotik öncesi ölçülen OD ile antibiyotik sonrası ölçülen OD arasında anlamlı fark bulunmadı (P>0,05). Ancak biyofilm üretimi pozitif 77 klinik izolatın 33'ünde, kolistinin yüksek konsantrasyonlarında (64µg/ml) OD'de azalma saptandı. Kolistinin biyofilm inhibitör konsantrasyonları (BİK) mikrotitrasyon plağında boncuklar kullanılarak araştırıldı. Çalışılan izolatların BİK90 ve MİK90 değerleri karşılaştırıldı. BİK90 değeri, MİK90 değerinin 512 katı olarak bulundu. Sonuç olarak oluşan biyofilm antibiyotik tedavisine, aynı genetik materyale sahip serbest yaşayan bakterilere oranla 100-1000 kat tolerans veya direnç gösterebilmektedir. A. baumannii suşlarında biyofilm oluşumunu etkileyen faktörler bir suşun farklı koşullarda farklı biyofilm oluşturma eğilimi gösterebileceğini göstermektedir ve biyofilm oluşumu antibiyotiklere direnç gelişiminde önemli rol oynamaktadır.Anahtar Sözcükler: Acinetobacter baumannii, Kolistin, Biyofilm, BİK, OD

In this study, the ratio of biofilm forming Acinetobacter baumannii isolates obtained from various clinics, methods that are used for the detection of biofilm formation and efficacy of colistin on biofilm were investigated.One hundred fifty-two A. baumannii isolates recovered from various clinical samples were included in the study. Tube method and microtitration plate method for the detection of biofilm formation were compared in the study. Formation of a film layer on the tube surface was considered as positive reaction. Of the 152 A. baumannii isolates, biofilm formation was found negative for 83 (54,6%) and positive for 69 (45,4%), following the qualitative evaluations. As a result of the quantitative evaluation based on absorbance measurements performed by microtitration method using crystal violet, for 75 (49,3%) biofilm was found negative and moderate biofilm formation and strong biofilm formation were detected in 68 (44,7 %) and 9 (5.9%), respectively. Correlation was found in the comparison of microtitration plate method and tube method for the detection of biofilm formation (p<0.001). The study was continued with 77 isolates that were positive for biofilm formation by microtitration plate. Efficacy of colistin on biofilm forming A. baumannii isolates was determined by using 96-well microtitration plate. Biofilms formed the night before were added with antibiotics with different concentrations and then their optical densities (O.D.) were measured by ELISA reader. No statistically significant difference was found between optical densities measured before and after the antibotic (P>0,05). However, in 33 of 77 clinical isolates that were positive for biofilm formation, decrease in O.D. was detected in the high concentrations of colistin (64µg/ml). Biofilm inhibitory concentration (BIC) values of colistin were investigated by using glass beads. BIC90 and MIC90 values of the tested isolates were compared. BIC90 value was 512-fold higher than MIC90 value. As a result, biofilm can exhibit 100-1000 fold tolerance and resistance to antibiotic treatment compared to free-living bacteria that contains same genetic material. The factors that affect biofilm formation in A. baumannii strains show that a strain can exhibit a tendency to form different biofilm under different conditions and biofilm formation plays an important role in the development of resistance to antibiotics.Key Words: Acinetobacter baumannii, Colistin, Biofilm, BIC, O.D.