Epidermal growth faktör (EGF) ve EGF yüklenmiş polikaprolakton skafoldun tendon defekt iyileşmesine etkileri

Abstract

Genel Bilgi: En uygun histolojik ve anatomik tendon iyileşmesini sağlamak için,Platelet'ten zengin plazma (PRP), mezenkimal kök hücre uygulamaları, kemik morfojenikprotein, kemik iliği aspiratı, büyüme faktörleri (bFGF, HGF, rhPDGF-BB, TGF-b, VEGF)geleneksel tedavi protokolüne eklenmektedir. Epidermal Growth Faktör (EGF), hücregelişmesini, farklılaşmasını EGFR reseptörüne bağlanarak sağlayan bir büyüme faktörüdür.Günümüzde EGF' in cilt rejenerasyonunda epidermisler arasında köprüleşmeyi içeren,özellikle diyabetik ayak gibi kronik yara problemleri olan hastalarda klinik uygulanmalarıvardır. Bu çalışmada, daha önce araştırılmamış olan defektif tendon tamiri ve iyileşmesindeEGF'in potansiyel rolünün araştırılması hedeflenmiştir.Gereç ve Yöntemler: Hayvan deneyi çalışmasında 30 tane Yeni Zellanda beyaz tavşanınınaşil tendonunda 1 cm büyüklüğünde defekt oluşturuldu. Herbirinde 10 tendon bulunan 3denek grubu oluşturuldu; (1)`Sham grubu: 1 cm lik tendon defekti gap bırakılarakemilmeyen dikiş ile `splint`leme uygulandı. (2) EGF(+) grup: 1 cm lik tendon defektine`gap` bırakılarak emilmeyen dikiş ile `splint`leme uygulandı ve defekt oluşturulanbölgeye 25 μg/kg EGF enjekte edildi. (3) Skafold+EGF(+) grup: 1 cm lik tendondefektine 25 μg/kg EGF yüklenmiş dönüşebilen, poroz polikaprolakton (PCL) `skafold`yerleştirilerek emilmeyen dikiş ile tespit edildi. 2. ve 3. Gruplara aynı dozlarda EGFenjeksiyonuna postoperatif gün aşırı 10 gün devam edildi. 8. haftada hayvanlar sakrifiyeedildikten sonra sonra aşil tendon tamiri ve rejenerasyonu histolojik ve biyomekanik olarakincelendi. Histolojik incelemede ışık mikroskopi yöntemi kullanıldı. Işık mikroskopiyöntemi için dokular %10 formalinde fikse edildi. Bütün parçalar parafine gömüldü, 10mm kesitlere ayrıldı, Hematoksilen - Eosin (H&E) ve Masson's trichrome ile boyandı.Biyomekanik çalışma, hayvanlar sakrifiye edildikten hemen sonra tendonlar tazeliğinikorurken uygulandı. Çekme testi uygulanan aşil tendonlarında kopma kuvveti, kopmaanındaki uzama miktarı ve young modulus değerleri ölçüldü. Tüm prosedürler HayvanAraştırma Etik Kurulundan onay alınarak yapılmıştır.Bulgular: Bütün denek gruplarında, defektin iyileştiği ve köprüleşmenin olduğumakroskopik olarak gözlemlendi. Histolojik olarak `Sham` grup: Damar formasyonu veTip 3 kollojenin yeni yapılmaya başlanmış olduğu gözlemlendi. Nadir adipozit izlendi.EGF (+) grup: Tendon içinde damar formasyonu, periferal sinir tomurcuklanması, dahafazla adipoz dokular gözlemlendi. Tamamen tendon rejenerasyonu için sonuçta Tip 1kollajene dönüşen ve fibroblastlar tarafından üretilen yüksek düzeyde Tip 3 kollajengörüldü. Skafold + EGF(+) grup: damar formasyonu, periferal sinir tomurcaklanması yinegözlemlendi fakat adipoz doku miktarı, ve üretilen Tip 3 kollajen mıktarı EGF(+) grup ilekarşılaştırıldığında daha az olduğu gözlemlendi. Tip Ⅰ/Tip Ⅲ kollajen oranının en fazlaSkafold + EGF grubunda olduğu, en az ise Sham grubunda olduğu saptandı. Biyomekanikolarak, kopma kuvvetleri açısından 3 deney grubu ve kontrol grupları arasında istatikselolarak anlamlı fark saptanmadı(p>0,05). Kopma anındaki uzama miktarı açısından dagruplar arasında anlamlı fark saptanmadı(p>0,05). Young modulus açısından 3 deney grubuarasında anlamlı fark saptanmadı(p>0,05) ama kontrol grubuyla EGF ve Skafold + EGFgruplarının ikili karşılaştırılması sonucunda anlamlı fark olduğu saptanmıştır(P<0,05).Sonuçlar: Geleneksel tedavi ile beraber EGF uygulanması daha uygun ve histolojik olarakileri düzeyde tendon iyileşmesi ile sonuçlandı. Bizim hipotezimiz; EGF uygulanması,damarlanmanın artması, damarda endotel hücreye komşu ` perisit` hücrelerin (kökhücrelerin) defekt boyunca toplanması, iyileşmede gerekli enerjinin sağlanabilmesi içintendon defekt bölgesinde yağ hücrelerinin gelişiminin görülmesi yüksek doku onarımınınolabileceği histolojik olarak göstermiştir. Kopma kuvvetleri açısından gruplar arasındaanlamlı bir fark saptanmamıştır. EGF eklenmesi tendon iyileşmesini biyomekanik açıdannegatif etkilememiştir. Biyomekanik açıdan olumsuz etkileri bulunmayan EGF'in, Tip Ⅰ/Tip Ⅲ kollajen oranını artırarak histolojik olarak daha uygun ve daha ileri seviyede tendoniyileşmesinini sağladığı gözlemlendi. Tedaviye EGF eklenmesiyle histolojik olarak etkintendon iyileşmesi elde edildi. Tedaviye EGF + skafold birlikte eklenmesiyle en etkintendon iyileşmesi elde edildi. Skafoldun boşluk doldurarak ve büyüme faktörününetkinliğini artırarak daha az Tip 3 kollajen formasyonu ve böylece daha hızlı tendon tamiriolabileceği savı da ortaya çıkmıştır.

Introduction: In order to obtain the most accurate anatomical and histological tendonregeneration, therapies including the administration of platelet rich plasma (PRP), bonemarrow aspiration, bone morphogenic protein, mesenchymal stem cells and growth factors(bFGF, HGF, rhPDGF-BB, TGF-b, VEGF) are being applied along with the conventionaltreatment. Epidermal growth factor (EGF) is a growth factor that stimulates cell growth,proliferation and differentiation through binding EGFR cell surface receptor. Its currentclinical application includes the bridging in between epidermis fragments in skinregeneration. In this study, the aim was to investigate the potential role of EGF in tendonrepair and regenaration which has not been investigated previously.Material and Methods: In this preclinical study, 1 cm size defects were created on one ofthe Achilles tendon of 30 New Zealand white rabbits. 3 experimental groups of 10 tendonswere made including:(1) `Sham` group: 1 cm tendon defect was splinted leaving the gapwith non absorbable suture; (2) EGF(+) group: 1 cm tendon defect was splinted leaving thegap with non absorbable suture and 25 μg/kg EGF injection was made in the defect; (3)Scaffold+ EGF(+) group: 1 cm tendon defect was grafted with biodegradable, porouspolycaprolactone (PCL) scaffolds loaded with 25 μg/kg EGF and stabilized using nonabsorbable suture. In groups 2 and 3, same dose EGF injections were made every other dayfor 10 days. Animals were sacrificed at 8 weeks postop, and Achilles tendon repair andregeneration was investigated by histopathological and biomechanics analysis. The tissueswere rapidly fixed in 10% formalin and processed for routine light microscopy. Allspecimens were embedded in paraffin, 10 mm sections were cut and stained byhematoxylin and eosin (H&E) and Masson's trichrome. The biomechanical study wasperformed immediately after the animal was sacrificed and the tendons were maintainedfresh. Pullout force test was performed for Achilles tendons and then was measuredbreaking force, amount of elongation at break and young modulus. All procedures wereapproved by Animal Research Ethical Committee.Results: It was observed macroscopically that defects healed and bridged in all of theexperimental groups. Histologically, `Sham` group: Damar formation and Type 3 collagenhave been observed to be newly constructed. Rare adiposity was observed EGF(+) group:vessel formation, peripheral nerve buds and more adipocytes were observed inside thetendon. A high level of type III collagen was detected which was laid by fibroblasts to bereplaced by type I collagen eventually for complete tendon regeneration.Scaffold +EGF(+)group: vessel formation and peripheral nerve buds were again observed,but the amount of adipocytes and laid type III collagen were less compared to EGF(+)group. Type Ⅰ/Type Ⅲ collagen ratio was highest in Skafold + EGF group and at least insham group. Biomechanically, there was no statistically significant difference between the3 experimental groups and the control groups in terms of the breaking forces (p> 0,05).There was no significant difference between the groups in terms of the amount ofelongation at break (p> 0,05). Young modulus was not significantly different between thethree experimental groups (p> 0,05) but it was found that there was a significant differencebetween control group , EGF and Skafold + EGF groups (P <0,05).Conclusion: EGF application together with the conventional therapy led to moreappropriate, advanced tendon regeneration histologically. Our hypothesis is; Thehistological demonstration that EGF application, increased vascularity, accumulation of`pericyte` cells (stem cells) adjacent to the endothelial cell in the vasculature, andappearance of the development of fat cells in the tendon defect region in order to providethe necessary energy for healing can provide high tissue repair. There was no significantdifference between the groups in terms of breaking forces. EGF application did notnegatively affect tendon healing in biomechanical aspects. It was observed that EGFwithout biomechanical adverse effects improves histologically more appropriate andadvanced tendon healing by increasing the proportion of Type I/Type Ⅲ collagen.Histologically effective tendon healing was achieved by the addition of EGF. Treatmentwith EGF + scaffold was obtained the most effective tendon healing. Scaffold implantationinto the defect as the void filler and by increasing the effectiveness of the growth factor,resulted in less type III collagen formation and thus faster tendon repair response.