Çeşitli ubiquitin aktive edici E1 enziminlerinin ubiquitin benzeri domainlerinin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve izotopik olarak işaretlenmesi

Abstract

Ubiquitin 76 aminoasit içeren, yaklasık 8.5kDa ağırlığında olan, evrimsel olarak iyikorunmus, ısıya oldukça dayanıklı bir proteindir. Ubiquitinin diğer proteinlere bağlanmasıubiquitilasyon olarak ifade edilir. Ubiquitilasyon translasyon sonrası modifikasyonların enönemlilerinden biridir. Ubiquitilasyon tepkimesi üç enzimi içeren kademeli bir mekanizmaseklinde gerçeklesmektedir. Bu enzim kaskatında yer alan ilk enzim ubiquitin aktive edicienzimdir ve ubiquitine ATP varlığında bağlanır, aktive olan ubiquitin diğer enzim olanubiquitin konjuge edici enzim sayesinde bu enzime bağlanır en son olarak üçüncü enzimubiquitin ligaz ile de hedef proteine bağlanan ubiquitin 26S proteazom sistemi ile degradeolur. Ubiquitilasyon hücrede, onkogenez, nöral ve kas dejenerasyonu, hücre siklusu, apoptosisvb. hücresel fonksiyonlarda görev almaktadır. Sadece ubiquitin değil ubiquitin benzeridomainleri de hücrede benzer yapısal görevlerde rol almaktadırlar.Bu çalısmada, ubiquitin aktive edici enzimlerin ve ubiquitin benzeri domainlerininyapılarını belirlemek ve ubiquitilasyon sistemindeki diğer bilesenler ile etkilesimlerini tespitedebilmek amacıyla çesitli E1 enzimlerinin beta-grasp domainlerinin üretilmesi hedeflendi.Bunun amaçla; Uba1, Uba3 ve Ube1L beta-grasp domain genleri modifiye pQE-30varyantları pQE-308HT ve pQE-30GB1 plazmitlerinin içerisine klonlandı. Klonlananproteinlerin, bakteriyel sistemde GB1 çözünürlük tagı ile füzyon protein olarak ekspresedilerek üretimi gerçeklestirilip saflastırıldı. NMR çalısmaları için M9 minimal ortamında15Nve 15N ile 13C isaretli protein üretimi gerçeklestirildi. Çözünürlük tagı olan GB1 domaininiayırmak için TEV proteaz enzimi ile kesme reaksiyonu gerçeklestirildi.Çalısmada üretilmesi hedeflenen proteinlerden UbaI ve Ube1L beta-grasp domainlerininhem 8HT hem de GB1 taglarıyla ekspresyonunda proteinler çözünmez halde ekspres oldu.Çözünür halde proteinleri elde edebilmek için denatüre kosullarda saflastırıldı ama proteinleryine çözünür halde elde edilemedi. Uba3'ün ise kısmen çözünür olarak ekspresyonugerçeklestirildi ve yapısal çalısmalar için izotopik olarak isaretli protein üretimigerçeklestirildi.Anahtar Kelimeler: Ubiquitin, Klonlama, Protein Ekspresyonu

Ubiquitin is a thermal, approximately 8.5kDa weighted protein which includes 76 aa andresistant against heat. Connecting of ubiquitin to the other proteins is defined asubiquitilation. Ubiquitilation is one of the most important modifications that occurs after thetranslation. Ubiquitilation reaction is a cascat mechanism with three enzymes. The firstenzyme activates the ubiquitin and ties to ubiquitin by means of ATP. Actived ubiquitin istransfered by means of ubiquitin konjuged enzyme and with the helps of third enzyme ofubiquitin ligaz transfered to substrat. Ubiquitilation has a role in oncogenes, neural andmuscle degeneration, cell siclus, apoptosis and functions of the cell. Not only the Ubiquitinbut also the domains like it has a role in structural functions of the cell.In this study, production of various E1 enzymes beta-grasp domains was aimed in order toidentifying the structure of ubiquitin activating enzymes and ubiquitin alike domains also thecomponents and reactions of ubiquitilation system. For this reasons, Uba1, Uba3 and Ube1Lbeta-grasp domain genes were clonned in modified pQE-30 variations pQE-308HT and pQE-30GB1 plasmids. Then, clonned proteins, in bacterial system which contains GB1 solubilitytag, was produced and purified by expressing as fussion protein. 15N and 15N - 13C includedprotein were produced in M9 minimal medium for NMR studies. In order to seperate GB1solubility tag from the protein, TEV protease enzyme was used by means of reaction.The UbaI and Ube1L beta-grasp domains, which were aimed to be produced in this study,were expressed as unsoluable proteins both in expression of 8HT and GB1 tags. However,that were purified in denature conditions to get soluable proteins. Expression of Uba3 resultedin partial solubility. Thus, isotopic labeling protein production was completed for structuralstudies.