Picoa juniperi, picoa lefebvrei türlerinin sekonder metabolitlerinin saflaştırılması, karakterizasyonu ve biyolojik aktivitelerinin incelenmesi

Abstract

Bu tez çalışmasında, Anadolu'da doğal olarak yayılış gösteren, ticari potansiyeli olan, Picoa juniperi ve Picoa lefebvrei türlerinin biyolojik aktiviteleri, kimyasal bileşenleri ve bu aktiviteye sahip olan bileşenler araştırıldı. Çalışmada Elazığ-Malatya civarından toplanan Picoa juniperi Vittad ve Denizli'den toplanan Picoa lefebvrei (Pat.) Maire türleri uygun koşullarla kurutulduktan sonra, sırasıyla n-hekzan, kloroform, aseton ve metanol ile oda koşullarında ekstrakte edildi. Metanol ekstresinden geriye kalan trüflerin 80˚C'deki su ile ekstraksiyonu yapıldı ve farklı polaritelerde 5 farklı ekstre elde edildi. İlgili türlerin biyolojik aktivitelerini belirlemek için her bir türden elde edilen ekstrelerin antioksidan aktivitesi, enzim inhibisyon aktivitesi (antikolinesteraz ve üreaz) ve in vitro koşullarda Akciğer Kanseri (H1299), Meme Kanseri (MCF-7), Prostat Kanseri (PC-3) hücre hatları ve Fare Fibroblast hücrelerine (L929) karşı toksisiteleri test edildi. Ektrelerin antioksidan aktivite testleri, β-karoten renk açılımı yöntemi, DPPH serbest radikali giderim aktivitesi, ABTS katyon radikali giderimi aktivitesi, CUPRAC yöntemi ve metal şelatlama kapasitesi olmak üzere 5 farklı metotla araştırıldı. Antikolinesteraz enzim aktivitesi ise asetilkolinesteraz (AChE) ve bütirilkolinesteraz (BChE) enzim inhibisyon aktiviteleri yöntemi kullanılarak belirlendi. P. juniperi ve P. lefebvrei'nin metanol ekstresinin 800 µg/mL'de DPPH serbest radikal giderim aktivitesi inhibisyonu sırasıyla %58,27±0,19; %57,54±0,01 iken, ABTS katyon radikali giderimi %91,56±0,10; %91,47±0,02 olarak hesaplandı. Her iki trüf türünün, metanol ve su ekstreleri üreaz enzim inhibisyon aktiviteleri standart olarak kullanılan tiyoüreye kıyasla orta standartta aktivite göstermektedir (%53,79±0,40, %40,96±0,07; %55,42±0,86, %41,59±0,74). İlgili kanser hücrelerine karşı ekstrelerin gösterdiği toksisiteler, onların %50 canlılık değerleri hesaplanarak belirlendi. Bu sonuçlara göre, Picoa lefebvrei su ekstresinin Akciğer Kanseri (H1299) ve Prostat Kanseri (PC-3) hücre hattına karşı toksik etkileri yüksek iken, L929 fibroblast hücresi üzerine toksisitesi düşüktür. Prostat Kanseri (PC-3) hücre hattında P. lefebvrei % canlılık %38,2'ye kadar düşerken P. jüniperi'de %49,9'a kadar düşmüştür. Meme Kanseri (MCF-7) hücre hattında ise P. lefebvrei metanol ekstresi %41,5'e düştüğü; buna karşılık, Picoa juniperi'de %54,2'ye kadar düştüğü hesaplanmıştır. Meme Kanseri (MCF-7) ve Prostat Kanseri (PC-3) hücre hattı üzerinde yapılan çalışmada her iki türün metanol ekstresinin daha yüksek toksisiteye sahip olduğu, ancak P. lefebvrei su ekstresinin Akciğer Kanseri (H1299) hücre hattına karşı diğer ekstrelerden çok daha etkili olduğu görülmüştür (200 µg/mL oranında %25,6'dır).Elde edilen antioksidan ve sitotoksik aktivite sonuçlarına göre her iki türün metanol ve kloroform ekstrelerinin, antioksidan aktivite kontrollü olarak, izolasyonları gerçekleştirildi. Buna göre, sırasıyla n-hekzan, kloroform, aseton, metanol ve sıcak su ekstrelerinden elde edilen biyoaktif bileşiklerin izolasyonları, kolon kromatografisi, ince tabaka kromatografisi, preperatif HPLC teknikleri kullanılarak gerçekleştirildi. Saflaştırılan bileşiklerin 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, FTIR ve MS spektrumları alınarak yapıları aydınlatıldı. Buna göre, Picoa lefebvrei ve Picoa juniperi'den toplam 17 bileşiğin yapısı tam olarak aydınlatıldı. Picoa juniperi'den elde edilen bileşikler Brassikasterol (1), Ergosterol (2), Ergosterol endoperoksit (3), Ergosta 5,22-dien 3-O-β-ᴅ-glukopiranozit (4), Juniperon A (5), Juniperon B (6), Mannitol (7), Adenozin (8), Linoleik asit, Oleik asit (9) iken; Picoa lefebvrei'den elde edilen bileşikler Brassikasterol (10), Ergosta 5,22-dien 3-O-β-ᴅ-glukopiranozit (11), Urasil (12), 1-β- L-xylofuranosil (13), Eritriol (14), α-ᴅ-glukopiranozil-α-ᴅ-glukopiranozit (15), Brasskcasteril linoleat (16), 5α-6α epoksi ergosta-7,22-dien-3β-ol (17)'dur. Bu bileşiklerden Picoa juniperi'den elde edilen Juniperon A (5), Juniperon B (6) bileşikleri bu tez çalışmasıyla ilk defa izole edilip yapısı aydınlatılmıştır. Ayrıca her iki türün polisakkaritleri uygun yöntemlerle ayrıştırıldı ve HPLC ve FTIR ile yapıları karakterize edildi. Saflaştırılan polisakkaritlerin antioksidan aktiviteleri belirlendi. Bunlara ek olarak her iki türün fenolik bileşenleri HPLC-DAD sistemiyle araştırıldı. Elde edilen sonuçlara göre fumarik asitin hem P. juniperi'de hem de P. lefebvrei'de ana bileşik olduğu tespit edildi (165,2 µg/g;12,6 µg/g). Bu tez çalışmasında izole edilen 17 bileşiğin miktarı yeterli olanların DPPH serbest radikal giderimi, ABTS katyon radikali giderimi ve Meme Kanseri (MCF-7) ve Fare Fibroblast (L929) hücre hatlarına karşı toksisiteleri in vitro testlerle belirlendi. Yapısı aydınlatılan bileşikler arasında, Brassikasterol, Ergosterol, Ergosta 5,22-dien 3-O-β-ᴅ-glukopiranozit, Adenozin, 1-β-L-xylofurasil, 5α-6α epoksi ergosta-7,22-dien-3β-ol'ün kanser hücrelerine karşı toksik etki gösterdiği; 1-β-L-xylofurasil, Adenozin bileşiklerinin antioksidan etkilerinin olduğu tespit edildi.

In this thesis, the biological activities of Picoa juniperi and Picoa lefebvrei species which are naturally distributed in Anatolia and have commercial potential, were investigated. In this study, Picoa juniperi Vittad collected from Elazığ-Malatya and Picoa lefebvrei (Pat.) Maire collected from Denizli and their species were dried under appropriate conditions and extracted with n-hexane, chloroform, acetone and methanol respectively under room conditions. Soaked in methanol extract, the residues of truffle were extracted with water at 80˚C and 5 different extracts of different polarities were obtained. To determine the biological activities, antioxidant activities and enzyme inhibition activities (anticholinesterase and urease) of each extract obtained from these species, as well as their toxicity against Lung Cancer (H1299), Breast Cancer (MCF-7), Prostate Cancer (PC-3) cell lines and Mouse Fibroblast cells (L929) were tested in vitro conditions. Antioxidant activity tests of the extracts were investigated with 5 different methods that are β-carotene bleaching method, DPPH free radical scavenging activity, ABTS cation radical scavenging activity, CUPRAC method and metal chelating capacity respectively. Anticholinesterase enzyme activity was determined by using acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) enzyme inhibition activity methods. 800 µg/mL DPPH free radical reducing activity inhibition of P. juniperi and P. lefebvrei's methanol extracts are 58.27±0.19% and 57.54±0.01% respectively; while their ABTS cation radical reducing activity inhibitions are calculated as 91.56±0.10% and is 91.47±0.02%. The urease enzyme inhibition activities of methanol and water extracts of both truffle species showed moderate activity compared to thiourea which sets a standard (53.79±0.40%, 40.96±0.07%; 55.42±0.86%, 41.59±0.74%). Toxicities of the extracts against the abovementioned cancer cells were determined by calculating their 50% viability. According to these results, water extract of Picoa lefebvrei is highly toxic to Lung Cancer (H1299) and Prostate Cancer (PC-3) cell lines, while its toxicity on L929 fibroblast cell is low. On Prostate Cancer (PC-3) cell line, P. lefebvrei methanol extract decreased to 38.2% while P. juniperi methanol extract decreased to 49.9% viability. On breast cancer cell line (MCF-7), P. lefebvrei methanol extract decreased to 41.5%, whereas Picoa juniperi decreased to 54.2%. In the study methanol extracts of both species had high toxicity on Breast Cancer (MCF-7) and Prostate Cancer (PC-3) cell lines, however, P. lefebvrei water extract was much more effective on Lung Cancer (H1299) cell line than the other extracts (25.6% at 200 µg/mL).According to the antioxidant and cytotoxic activity results, methanol and chloroform extracts of both species were isolated while their activities are controlled. In this respect, the isolation of bioactive compounds obtained from n-hexane, chloroform, acetone, methanol and hot water extracts was carried out by using column chromatography, thin-layer chromatography and preparative HPLC techniques. The structures of the purified compounds were elucidated by 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, FTIR and MS spectra techniques. Structures of 17 compounds obtained from Picoa lefebvrei and Picoa juniperi were fully elucidated. The compounds obtained from Picoa juniperi are Brassıcasterol (1), Ergosterol (2), Ergosterol endoperoxide (3) Ergosta 5,22-diene 3-O-β-ᴅ-glucopyranoside (4), Juniperon A (5), Juniperon B (6), Mannitol (7), Adenosine (8), Linoleic acid, Oleic acid (9). The compounds obtained from P. lefebvrei are as follows: Brassıcasterol (10), 5,22-diene 3-O-β-ᴅ-glucopyranoside (11), Uracil (12), 1-β-L- xylofuranosyl (13), Erythriol (14), α-ᴅ-glukopiranozil-α-ᴅ-glukopiranozit (15), Brassicasteryl linoleate (16); 5α-6α epoxy ergosta-7,22-dien-3β-ol (17). Juniperon A (5) and Juniperon B (6) were also isolated and their structures were elucidated for the first time by this thesis. Moreover, polysaccharides of both species were removed by appropriate methods and their structures were characterized by HPLC and FTIR. Antioxidant activities of purified polysaccharides were identified. Besides, phenolic compounds of both species were investigated by HPLC-DAD system. According to the results, fumaric acid is the main compound in both P. juniperi and P. lefebvrei species (165.2 µg/g; 12.6 µg/g).In this study, DPPH free radical scavenging, ABTS cation radical scavenging of the pure compounds with sufficient amount out of 17 isolated compounds, as well as their toxicity against Breast Cancer (MCF-7), Mouse Fibroblast cells (L929) were identified in vitro tests. Among other compounds whose structures were elucidated, it is identified that Brassicasterol, Ergosterol, Ergosta 5,22-diene 3-O-β-ᴅ-glucopyranoside, Adenosine, 1-β-L- xylofuranosyl, 5α-6α epoxy ergosta-7, 22-dien-3β-ol have toxicity against cancer cells, while 1-β-L- xylofuranosyl, Adenosine compounds were found to have antioxidant effects.