Escherichia coli`DE AŞIRI İFADE EDİLEN GENLERİN BOR TOLERANSINA ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI VE BORA BAĞLI GEN EKSPRESYON ANALİZLERİ

Abstract

Bor, birçok açıdan stratejik ve enigmatik bir elementtir. Borik asit ve bor bileşiklerinin birçoğu çeşitli bakteri hücrelerini öldürmekte veya üremesini inhibe etmektedir. Ancak bunu, hücredeki hangi molekülleri etkileyerek yaptıkları ve bu bileşiklere karşı kullanılan hücresel cevap mekanizmaları yeterince bilinmemektedir. Bundan dolayı, uygun model organizmalar kullanılarak, bor ile ilgili biyomoleküller, özellikle genler, proteinler ve metabolitler bulunmalıdır. Bu hedeflere ulaşabilmek için bu tez çalışmasında, genomik, proteomik, metabolomik ve gen ekspresyon analizlerini içeren yaklaşımlar kullanılmıştır.Bu tez çalışmasının ilk basamağında genomik yaklaşımı esas alınmıştır. Escherichia coli ASKA klon setinde yer alan 4123 adet suş, artan borik asit ortamında, genom boyu tarama deneylerine tabii tutulmuştur. Plazmitlerdeki genlerin ekspresyonunu indüklemek için 100 µM ve 33 µM IPTG kullanılmıştır. Kontrol suşuna kıyasla göreceli olarak yüksek borik asit konsantrasyonlarında yaşayan suşlar seçilmiştir. 100 µM IPTG kullanılarak yapılan genom boyu taramalardan 17 adet suşun göreceli olarak yüksek borik asit ortamında üreme gösterdiği bulunmuş ve sonuçlar çeşitli ek tekniklerle onaylanmıştır. 33 µM IPTG kullanılarak yapılan taramalardan bulunan ve onaylanan suşlar ise 52 adet olup, bu suşların içerdikleri genlerin fazla ifadesiyle, göreceli olarak yüksek borik asit konsantrasyonlarında üreyebildikleri belirlenmiştir. Göreceli olarak yüksek bor toleransına sahip suşlar, aceK, rfaQ, yjcF, ymdE, bdm, yeeY, yddV, recQ, ygcU, ptsA, ydeE, lacI, lacA, cobT, gatD, paaE, ugpC, prfH, yaiB, nusB, cbpM, malI, ydhD, yeaC, yeeT, yfjL, hcaD, ,elaB, hypC, yfjU, yqeK, yhiJ, rep, thiC, yifB, aceA, sgbE, fre, ytfG, sgcQ, rpsJ, yhcE, yhdL, tnaC, ytfA, ulaB, yjgX, yjhX, sgcA, chpS, yceP, yjhD, yrbB, gatR, yoeF, arpB, hybF, ygeM, ymfP, yicR, hpt, frlC, menD, yadI, ydiA, yfcT, arsB, yeiQ ve yddK genlerini taşımaktadır.Çalışmanın ikinci basamağında, 4123 gen klonunu içeren, `ASKA klon genomik kütüphane havuzu` elde edilmiş ve yüksek borik asit içeren ortamlarda zenginleştirme yöntemiyle seleksiyon yapılmıştır. Ayrıca, ASKA klon genomik kütüphane havuzunun, 'in vitro' plazmid kütüphanesi oluşturulmuştur. Plazmitler DH10b suşuna transforme edildikten sonra, yine zenginleştirme yöntemi ile seleksiyona tabii tutulmuş ve tolerant koloniler seçilmiştir. Her iki çalışmadan elde edilen tolerant klonların rekombinant plazmidlerinde yer alan genler Sanger sekanslama yöntemi ile belirlenmiş ve 9 adet gen bilgisine ulaşılmıştır. Bu genlerin isimleri dtd, yedL, yjbO, elfC, yfjK, yfiC, sufD, yecF, idnR'dir.Üçünçü aşamada proteomik teknolojisine başvurulmuştur. 2-DE (iki boyutlu jel elektroforezi) analizleri için, göreceli olarak yüksek borik asit ortamında üreme gösteren AG1(pCA24N

Boron (B) is a strategic and enigmatic element in many aspects. Boric acid and most boron compounds cause death or inhibit the growth of various bacterial cells. However, it is not well understood which biomolecules are targeted in the cell and response mechanisms are used against these boron compounds. Consequently, boron-related biomolecules, particularly genes, proteins and metabolites should be investigated using appropriate model organisms. Towards reaching these goals, the approaches of genomics, proteomics, metabolomics and gene expression analyzes were applied. In the first part of this thesis, genomic approach was used and a number of 4123 strains of the ASKA clone set belonging to Escherichia coli were subjected to genome-wide screening experiments in the presence of increasing boric acid concentrations. In order to induce the expression of the genes contained in the plasmids, 100 µM and 33 µM IPTG were used. Comparing to the control, the strains surviving at relatively high boric acid concentrations were selected. As a result of genome-wide screens using 100 µM IPTG, a number of 17 strains were found to grow in relatively higher levels of boric acid and the results were confirmed by various additional methods. The number of strains that were selected using 33 µM IPTG was 52, which were shown to grow in the presence of relatively higher boric acid concentrations owing to the over-expressed genes that they contain. The strains that have relatively higher boron tolerance possess the following cloned genes: aceK, rfaQ, yjcF, ymdE, bdm, yeeY, yddV, recQ, ygcU, ptsA, ydeE, lacI, lacA, cobT, gatD, paaE, ugpC, prfH, yaiB, nusB, cbpM, malI, ydhD, yeaC, yeeT, yfjL, hcaD, ,elaB, hypC, yfjU, yqeK, yhiJ, rep, thiC, yifB, aceA, sgbE, fre, ytfG, sgcQ, rpsJ, yhcE, yhdL, tnaC, ytfA, ulaB, yjgX, yjhX, sgcA, chpS, yceP, yjhD, yrbB, gatR, yoeF, arpB, hybF, ygeM, ymfP, yicR, hpt, frlC, menD, yadI, ydiA, yfcT, arsB, yeiQ ve yddK.In the second part of the study, `ASKA clone genomic library pool` containing 4123 gene clones was generated and selection was carried out by the enrichment method under the conditions of high boric acid levels. In addition, the `in vitro` plasmid library of the ASKA clone genomic library pool was obtained. After the plasmids were transformed into strain DH10b, the enrichment method was used again for selection and the tolerant colonies were chosen. The genes in the recombinant plasmids of the tolerant clones obtained from both studies were identified by the Sanger sequencing method. A number of 9 genes were found namely dtd, yedL, yjbO, elfC, yfjK, yfiC, sufD, yecF and idnR.In the third part, proteomic technology was applied. For 2-DE (two-dimensional gel electrophoresis), the strains AG1(pCA24N