Farklı şekillerde saklanan doku örneklerinde lenfoid hücre klonalitesinin moleküler yöntemlerle araştırılması

Abstract

Farklı Şekilde Saklanan Doku Örneklerinde Lenfoid Hücre Klonalitesinin Moleküler Yöntemlerle Araştırılması ÖZET Rutin patoloji incelemelerinde farklı solüsyonlarla tesbit edilmiş, parafine gömülü arşiv materyalleri kullanılmaktadır. Şüpheli B lenfosit proliferasyonlannda reaktif-neoplastik ayırım için immünofenotipik incelemeler yetersiz kalabilmekte, bu durumda moleküler incelemelere gereksinim duyulmaktadır. Tam amaçlı yapılan moleküler incelemelerde en sık PZR yöntemi tercih edilmektedir, immunoglobulin ağır zincir (IgH) genlerinin klonal olduğunun gösterilmesi tanısal yaklaşım için kuUanılmaktadır. Bu çalışmada, klonal olduğundan emin olumdan çeşitli B hücreli lenfoma olgularında, multipleks PZR ve heterodupleks analiz yöntemi kullanılarak tesbit solüsyonlarının, DNA kalitesi, miktarı ve saflığının, blok yaşının klonalite saptanmasına etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla 59 B hücreli lenfoma hastasına ait biyopsi materyallerinden elde edilen DNA örnekleri incelenmiştir. Bu materyallerin 42'si formalin, 7'si AFA, 6'sı Holland, solusyonuyla tesbit edilmiş, 4'ü tesbit solüsyonu bilinmeyen konsültasyon hastasına aittir. Materyallerin 11 'i 2005, 24 'ü 2004, 12'si 2003, 6'sı 2002, 6'sı 2001 yılına ait parafin bloklardır. BIOMED-2 kontrol primerleri kullanılarak yapılan multipleks PZR sonucunda, formalinle tesbit edilmiş hasta materyallerin %92.8'inden, AFA ile tesbit edilmiş materyallerin %100'ünden, holland ile tesbit edilmiş materyallerin %16.7'sinden olmak üzere tüm doku materyallerinin %84.8'inden iyi kalitede (<400 bç) DNA molekülü elde edilmiştir. DNA örnekleri standart kit ile izole edildiğinden saflığın klonalitenin saptanmasında etkili olmadıği görülmüştür. Ancak, DNA miktarı ve kalitesi arttıkça klonalitenin saptanma oranının arttığı görülmüştür. BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936 IgH (VH-JH) ve IgH (DH- JH) primerleri ile yapılan multipleks PZR ve heterodupleks analiz sonrasında, çalışılan B hücreli lenfomalann %81.4'ünde klonalite saptanmıştır. Formalinle tesbit edilmiş B hücreli lenfoma olgularında %90.5 oranında ve AFA ile tesbit edilmiş olgularda %100 oranında klonalite saptanırken, holland ile tesbit edilmiş olan B hücreli lenfoma olgularında klonalite saptanamamıştır. DNA iyi kalitede olmasına rağmen PZR analizi başarısız olan 4 (%8) olgu saptanmıştır. Bunlar klonal olması beklenen DBBHL, HCL, BL, FL şeklindeki farklı lenfoma tiplerine aittir. Sonuç olarak, kullanılan multipleks PZR ve heterodupleks analiz yöntemi rutin patoloji laboratuvarlarmda, şüpheli lenfoproliferatif olgulara tam koymada yüksek duyarlılıkta ve güvenilirliktedir. Tesbit solüsyonlarının DNA kalitesi üzerine ve dolayısıyla da B hücreli lenfoma olgularında klonalite saptanması üzerine etkisi olmaktadır. Tesbit solüsyonları arasında en iyi sonuç sırasıyla AFA ve formalin ile elde edilmiştir. Holland solüsyonun moleküler analizlerde kullamlmaması gerekir. Beş yıllık periyodun bloklarda DNA kalitesine etkisi bulunmamaktadır. Parafine gömülü doku örnekleri kullanıldığında klonalite amaçlı PZR çalışılmadan önce tanımlanmış kontrol primerleri kullanılarak multipleks PZR ile DNA kalitesinin ölçülmesi gerekir. Anahtar Kelimeler: B Hücre Klonalitesi, Heterodupleks Analiz, Multipleks PZR

The detection of the B lymphoid cell clonality with molecular methods on paraffin embedded materials fixed in different solutions Summary Paraffin embedded tissue samples are used for routine pathology practice. Routine histopathology and immunohistochemistry methods may not be enough to differentiate benign reactive proliferations and suspicuous neoplastic lymphoid proliferations. In this occasion molecular methods are essential for differentiation. PCR is the most preferred molecular method for this purpose. Clonality of Ig heavy chain genes is used for diagnostic purposes in these occasions. In this study we used B-cell lymphoma cases which we know clonal Ig heavy chain gene rearrangements. We used multiplex PCR method with heteroduplex analysis. The effect of fixation solution type and block age on DNA quality, quantity and purity were analysed first at the beginning of the study. The DNA samples obtained from paraffin embedded blocks of 59 B-cell lymphoma cases. 42 of them were fixed in formaline, 7 in AFA, 6 in Holland solutions. Four cases have consultation blocks where the fixation status was unknown. 11 blocks were less than one year old, 24 were one year old, 12 were two years old, 6 were three and 6 were four years old. BIOMED-2 conrol primers were used for DNA quality PCR analysis. All the samples from AFA fixed tissues have high quality (<400 bp) DNA. However 92.8% of the formalin-fixed samples, 16.7% of Holland-fixed samples have high quality DNA. The success in determination of clonality results increased with the increase in DNA quantity and quality. Multiplex PCR method with heteroduplex analysis with BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936 IgH (VH-JH) ve IgH (DH-JH) primers was performed. 81,4% of B-cell lymhomas were found clonal with this method. The clonality was detected in 90.5% of formalin-fixed cases and 100% of AFA-fixed cases whereas no success was seen in Holland-fixed cases. Four cases (8%) were failed to give clonality results although they have good quality DNA. These cases were diagnosed as DLBCL, HCL, BL, FL. In conclusion, multiplex PCR method with heteroduplex analysis can reliably be used for the differentiation of suspicious lymphoid proliferations. This method is highly sensitive and specific. The most important point for the success of the method on paraffin embedded material is the fixative and the fixation status. AFA and formalin are suitable solutions for this purpose whereas Holland solution is not recommended. The block age up to five years does not seem to effect the DNA quality and the success of clonality analysis. Checking the quality of DNA samples before clonality analysis is essential for interpretation of the negative results. Key Words: B-Cell Clonality, Heteroduplex Analysis, Multiplex PCR 11