İzole edilmiş sıçan kondrositleri ve polimerik biyomalzemelerin kullanımıyla kıkırdak doku mühendisliği

Abstract

Wistar sıçanların artiküler kıkırdağından aseptik koşullarda enzimatik olarak izole edilen kondrositler, üçboyutlu statik ve dinamik kültürler ile paralel deney olarak tek tabaka kültürlerde çoğaltıldı. Üç boyutluortamı sağlamak amacıyla kalsiyum alginat hidrojeli kullanıldı ve izole edilmiş hücreler kalsiyum alginatjeli içerisine enkapsüle edildikten sonra biyoreaktör içerisine konularak dinamik kültür şartları ile TGF-ß'nın etkisi incelendi. Statik üç-boyutlu ve tek tabaka kültürler ise kontrol olarak yürütüldü.Kondrositlerin, in vitro şartlarda dediferansiye olmadan çoğaltılmalarını sağlamak amacıyla hazırlanankondrojenik vasat, 20%FCS (fetal sığır serumu), esansiyel olmayan amino asit çözeltisi, L-glutamin,askorbik asit, ITS+ (insülin, transferrin, senoik asit), antibiyotik-antimikotik çözeltisi ve TGF-ßDMEM'den oluşturuldu. Kondrositlerin TGF-ß içeren kondrojenik vasatta farklılaşmadan hızlaçoğalabildikleri gözlendi.İmmünhistokimya çalışmaları, kondrositlerin üç-boyutlu statik kültürlerde düşük miktarda kollajen tip-1,daha yüksek düzeyde kollajen tip-2 sentezi yapabildiklerini gösterdi. Buna karşın, kontrol tek tabakakültürlerde kollajen tip-2 sentezinin yanı sıra, daha yüksek düzeyde kollajen tip-1 sentezinin gerçekleştiğigösterildi. Çalışmalar alginat lif içerisine enkapsüle edilen kondrositlerin, TGF-ß içeren STLVbiyoreaktördeki kültür şartları altında kollajen tip-2 ve agrekan boyaması için en iyi sonucu verdiğiniortaya koydu. Kollajen tip-2 için gözlenen kuvvetli antikor boyaması, hiyalin kıkırdak için spesifikliği vekültür ortamındaki doğal kıkırdağın rediferansiasyonunu gösterdi.ANAHTAR KELİMELER: Kondrosit, kıkırdak, doku mühendisliği, alginat, enkapsülasyon, üç-boyutlukültür, TGF-ß, biyoreaktör

The chondrocytes were aseptically isolated from the articular cartilage of Wistar rats by enzymaticdigestion, were proliferated under three-dimensional static and dynamic culture, as well as in parallelcontrol monolayer culture. Calcium alginat fibers were used to simulate the three-dimensionalenvironment. Isolated cells were placed inside the rotating bioreactor after that encapsulated with alginathydrogel, and effects of dynamic culture conditations and TGF- ß were investigated. Static threedimensionaland monolayer cultures served as the controls.For the proliferation of chondrocytes without dedifferentiation in in vitro culture conditions, the culturemedium consisted of DMEM containing 20% FCS, non-essential amino acids, L-glutamine, ascorbicacid, ITS+, antibiotics-antimicotics solution and TGF-ß was used. Results demonstrated that the ratchondrocytes had higher proliferation ability without dedifferentiation, in TGF-ß-containingchondrogenic medium.Immunohistochemistry studies revealed that while the chondrocytes in static 3D-culture expressed somelevel of collagen type-I, their collagen type-II expression was more intense in the bioreactor 3D-culturegroup. On the other hand, the control monolayer cultures did express collagen type-I, but expressed a lowlevel of collagen type-II throughout the culture. Studies indicated that the chondrocytes-encapsulated withcalcium alginate in TGF-ß-containing chondrogenic medium showed much better results, in terms ofcollagen type-II and aggrecan staining under dynamic culture conditions in the STLV bioreactor. Theuniform and strong staining of the matrix with the antibody against collagen type-II confirms specificityto hyaline cartilage and redifferentiation into the native cartilage tissue of the cultured constructs.KEY WORDS: Chondrocyte, cartilage, tissue engineering, alginat, encapsulation, three-dimensionalculture, TGF-ß, bioreactor.