Dejenerasyon sürecindeki kas dokusunda housekeeping genlerin ekspresyon düzeyinin incelenmesi

Abstract

RT-PCR ve kantitatif PCR uygulamaları, hücre ve dokuların çevresel uyaranlara verdikleri mRNA düzeyindeki cevabın incelenmesi için başvurulan yöntemlerdir. RT-PCR uygulamalarında ilgilenilen genin ekspresyon düzeyinin incelenebilmesi için dokuda ekspresyonu değişmeyen bir diğer genin ürünü olan mRNA ile standardize edilmesi gereklidir (normalizasyon). Bu amaçla çeşitli doku ve hücre tiplerinde kullanılan ve ekspresyonu minimal farklılık gösteren housekeeping genler kullanılmaktadır. Kısa ölçekli ve doku mimarisi değişiklikleri sergilemeyen deneylerde housekeeping genlerden uygun olanı seçilerek normalizasyon aşamalarında kullanılabilir. Ancak, kronik kas dejenerasyonu gibi, dokunun köklü değişiklikler sergilediği ve yeniden yapılanmaya gittiği durumlarda, bu genlerin ekspresyon düzeylerinin güvenilir ölçüde sabit olup olmadığı bilinmemektedir. Bu nedenle kas dokusu kronik dejenerasyon modeli gibi yaygın doku değişikliklerinin bulunduğu durumlarda güvenilir bir normalizasyon geni ihtiyacı vardır.Bu çalışmanın amacı, doku mimarisi değişikliklerinin sergilendiği iki farklı kronik kas dejenerasyonu modelinde, dejenerasyon sürecinde, hangi housekeeping genlerin ekspresyon düzeylerinin en az değişim gösterdiğinin incelenmesidir. Bu amaçla kronik kas dejenerasyonu modeli olarak ?denervasyon? ve ?tenotomi? modelleri kullanılmıştır. Her iki modelde de kontrlateral kas dokusu kontrol doku olarak kullanılmıştır. Çalışmada B-aktin, TBP, GAPDH ve HPRT ekspresyonları incelenmiştir. Çalışmanın sağlaması için izlenen ekspresyon miktarının kas atrofisi ile ilişkilendirilebilmesi amacıyla kas dokusunun yapısal proteinlerinden biri olan myozin ağır zincir ekspresyonu analizi de yapılmıştır.Anahtar Kelimeler: RT-PCR, normalizasyon, housekeeping gen, kas dejenerasyonu

RT-PCR and quantitative PCR applications are widely used for the assessment of transcriptional response that cells and tissues develop for external stimuli. For samples that have been collected over a time period or under various physiological conditions, RT-PCR technique is employed to observe any gene of interest. A housekeeping gene whose expression is believed to be stable is used to normalize the expression of the gene of interest. A large battery of genes are being used for the normalization of gene expression in short-term studies where tissue architectural changes are not observed. But under extreme conditions such as the chronic muscle degeneration, the tissue architecture is deteriorated and the cell population exhibit important variations. Thus the gene of choice for normalization has to be carefully assessed under such conditions. The aim of this study is to assess and compare the expression variations of various housekeeping genes on the course of two diverse models of muscle degeneration where large tissue architectural changes are observed. Denervation and tenotomy are the models that are chosen for the study where experimental interventions have been made on the right extremity of rats and the contralateral-side muscles have been utilized as control. The expression of B-actin, TBP, GAPDH and HPRT have been investigated. In order to assess the amount of tissue deterioration, a structural gene of muscle contractile apparatus, the myosin heavy chain is also analyzed.Key Words: RT-PCR, normalization, housekeeping gene, muscle degeneration