Bacillus pumilus Y7 tarafından üretilen katalaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Katalazlar (EC 1.11.1.6) antioksidan metalloenzimler sınıfına dahil olup başlıca işlevleri hidrojen peroksidin su ve moleküler oksijene parçalanmasıdır. Katalazlarla ilgili günümüzde yeni bulgular elde edilmektedir. Bu bulgulardan en çarpıcı olanı farklı kaynaklardan izole edilen bazı katalazların temel fonksiyonlarının yanında düşük seviyede oksidaz ve(ya) peroksidaz aktivitesi göstermelerinin keşfedilmesidir. Bu çalışmada Bacillus pumilus Y7 katalazının İkili Faz Ayırma Sistemi (ATPS) ile düşük maliyette ve yüksek verimde saflaştırılması amaçlanmıştır. Buna göre Luria Broth besiyerinde 37°C, 18 saat ve 200 rpm çalkalama hızında büyütülülen B. pumilus Y7 izolatından 7990 U (12 U/g) katalaz içeren ham enzim ekstraktı elde edilmiştir. %10 (a/a) Na2SO4, %15 (a/a) PEG4000 ve %3 (a/a) NaCl içeren pH 7,0'da hazırlanmış sistemden katalaz enzimi %123 verim ile 4,7 kat saflaştırılmıştır. Saflığın kontrolü SDS-PAGE ile gerçekleştirilmiş olup 59 kDa molekül ağırlığına sahip tek bir bant gözlenmiştir. Ayrıca saf enzimin KM-app değeri (11 mM), optimal sıcaklığı (37°C) ve optimal pH'sı (7,0) belirlenmiştir. Enzimin 30 ila 50°C 'de ve pH 7,0 ila 9,0 arasında kararlı olduğu belirlenmiştir. Aktivite boyama sonucu enzimde ikincil peroksidaz aktivitesinin varlığı tespit edilmiştir. Ayrıca %2,5 (h/h) konsantrasyonunda organik çözücülerden etanol, metanol, aseton ve DMSO'ya karşı dayanıklı olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak B. pumilus Y7 izolatının literatürde adı geçen diğer hücre içi katalaz üreticilerine göre yüksek miktarda enzim ürettiği bulunmuştur. Bu enzimin ATPS ile yüksek verimde alt fazda saflaştırıldığı tespit edilmiştir. Bu sayede oldukça pahalı ve enzim kaybına neden olan kromatografik yöntemler yerine zamandan tasarruf sağlayan, maliyeti ucuz ve kullanımı oldukça kolay olan ATPS sisteminin katalaz enzim saflaştırılmasında tercih edilebileceği gösterilmiştir.

Catalases (EC 1.11.1.6) belonging to metalloenzyme family catalyze the degradation of hydrogen peroxide to water and molecular oxygen. In this study, it has been aimed to purify catalase from Bacillus pumilus Y7 by aqueous two phase partitioning (ATPS) which provides low cost and high enzyme recovery. A crude enzyme extract containing 7990 U (12 U/g) catalase was obtained from the B. pumilus Y7 isolate grown on Luria Broth medium at 37°C for 18 hours and 200 rpm. The catalase enzyme was purified 4.7 times with 123% yield from the system prepared at pH 7.0 containing 10% (w/w) Na2SO4, 15% (w/w) PEG4000 and 3% (w/w) NaCl. Its purity was confirmed by SDS-PAGE where a single band of 59 kDa was observed. In addition, KM-app value (11 mM), optimal temperature (37°C) and optimal pH (7.0) of the pure enzyme were determined. The presence of secondary peroxidase activity was detected after activity staining. Additionally, it has been found stable in the presence of ethanol, methanol, acetone and DMSO at a concentration of 2.5% (v/v). In conclusion, B. pumilus Y7 isolate has been found to produce high amounts of enzyme compared to other intracellular catalase producers reported. It has been found that the enzyme has been purified at high yield in the bottom phase by ATPS. It has been shown that the ATPS system, which is cost effective and easy to use, can be preferred for catalase enzyme purification instead of the chromatographic methods which are very expensive and cause the enzyme loss.