Koca engerek, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758)`nın Güneydoğu Anadolu ve Kıbrıs alt türlerinin zehirlerinin proteomik ve spektroskopik yöntemlerle karşılaştırılması

Abstract

Bu çalışmada Koca Engerek, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758) türünün Güneydoğu Anadolu'da yayılış gösteren M. l. obtusa (Dwigubsky, 1832) ve Kıbrıs'ta yayılış gösteren M. l. lebetina (Linnaeus, 1758) alt türlerinin zehirleri arasındaki farklılıkların proteomik ve spektroskopik yöntemlerle saptanması amaçlanmıştır.Terraryum ortamında beslenmekte olan ergin iki M. l. obtusa ve iki M. l. lebetina örneğinden zehir sağılmış ve aynı alt türe ait bireylerden sağılan zehirler birleştirilerek liyofilize edilmiştir. Daha sonra toz örnekler çözülüp iki boyutlu jel elektroforezi ile zehir protein profilleri iki tekrarlı olarak elde edilmiştir. Birinci boyut için 17 cm uzunluğunda ve pH 3-10 aralığında IPG şeritler kullanılmıştır. Jeller Sypro Ruby ile boyanmış ve VersaDoc görüntüleme sisteminde görüntülenmiştir. Jel fotoğraflarının analizi PDQuest 8.0.1 programı kullanılarak yapılmıştır. Peptit kütle parmakizi yaklaşımıyla, MALDI-TOF kütle spektrometresinden elde edilen peptit m/z değerleri kullanılarak yapılan biyoinformatik analizler sonucunda proteinler belli oranlarda tanımlanmıştır. Ayrıca zehrin proteinler dışındaki içeriği hakkında da bilgi edinmek için Fourier Dönüşüm Kızılötesi Spektroskopisi (FT-IR) yöntemiyle liyofilize zehir örneklerinden orta kızılötesi bölgede çekim yapılmıştır ve kümeleme analizi ile zehir karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir.İki boyutlu jel elektroforezi sonucunda iki alt türün zehrinde ortak olarak bulunan proteinler tespit edilmekle birlikte, önemli ölçüde farklılıklar da görülmüştür. İki grup arasında logaritmik düzeltmeli ve düzeltmesiz t-testine göre anlamlı farklılık gösteren toplam 15 protein kümesi bulunmuştur. Özellikle ~20 kDa ve ~ pH 6 bölgesindeki protein profilleri önemli ölçüde değişkenlik göstermiştir. FT-IR çekimleri sonucunda; M. l. obtusa ve M. l. lebetina zehrinde 13 belirgin bant görülmüştür. İkincil türev spektrumlarında Amid II bölgesinde görülen farklılıklar proteinlerin ikincil yapı farklılıklarına işaret etmektedir. Ayrıca M. lebetina alt türlerinin ve Montivipera xanthina türünün zehir FT-IR spektrumları kümeleme analizi ile gruplandırılmıştır. MALDI-TOF kütle spektrometresinden elde edilen m/z değerlerinin biyoinformatik analizi sonucunda çeşitli engerek ve çıngıraklı yılan zehirlerinden fosfolipaz A2, metalloproteaz, metalloproteaz/disintegrin, serin proteaz, disintegrin, sisteince zengin salgı proteini, C-tipi lektin, vasküler endotelyal büyüme faktörü, sinir büyüme faktörü, L-amino asit oksidaz, hyaluronidaz, tripsin inhibitörü ailelerine ait proteinler tanımlanmıştır. Ayrıca Elapid, Hydophid, Colubrid ve kertenkele zehirlerinden de proteinler tanımlanmıştır. Macrovipera lebetina türünün zehri 2 boyutlu jel elektroforezi ile ve ham yılan zehri FT-IR teknikleriyle ilk kez incelenip kümeleme analizi yapılarak literatüre bu anlamda katkıda bulunulmuştur.

The aim of this study is to compare the venoms of the subspecies of Blunt-nosed Viper, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758) from South-Eastern Anatolia [M. l. obtusa (Dwigubsky, 1832)] and Cyprus [M. l. lebetina (Linnaeus, 1758)] by proteomic and spectroscopic methods.Venom was milked from two adult M. l. obtusa and M. l. lebetina specimens which were have been fed in terrarium. Venom samples were pooled in one tube for each subspecies and lyophilized. After that, lyophilized venom samples were reconstituted and venom protein profiles were obtained in duplicates by two dimensional gel electrophoresis. For the first dimension, 17 cm. immobilized pH gradient (IPG) strips with a pH 3-10 gradient were used. Gels were stained with Sypro Ruby and scanned by VersaDoc gel imaging system. Gel analysis were carried out using PDQuest 8.0.1 gel analyze program. Protein identification was achieved with peptide mass fingerprinting approach, by the bioinformatic analyses of the peptide m/z values obtained from MALDI-TOF mass spectrometer. Additionally, lyophilized venom samples were measured by FT-IR in the mid-infrared region in order to obtain information about not only the proteins, but the all molecular contents of venom and also venom characterization was made with the cluster analysis.As a result of two dimensional gel electrophoresis, number of shared protein spots were found between two subspecies. However, some significant differences were also seen. 15 protein spots were found statistically different between the replicate gels from two groups according to Student t-test both with and without logarithmic transformation. Important differences were found especially at ~20 kDa and ~ pH 6 region. As a result of the FT-IR measurements, 13 significant peaks were found on the spectrum of M. l. obtusa and M. l. lebetina venom. Differences on the second derivative spectrums at Amid II region indicate protein secondary structure differences. Additionally, venom FT-IR spectrums were obtained from Montivipera xanthina and two subspecies of M. lebetina were classified with cluster analysis. As a result of the bioinformatic analysis of the m/z values were obtained from the MALDI-TOF mass spectrometer, proteins belonging to the following families were identified from various true and pit viper venoms: phospholipase A2, metalloprotease, metalloprotease/disintegrin, serin protease, disintegrin, cysteine-rich secretory protein, C-type lectin, vascular endothelial growth factor, nerve growth factor, hyaluronidase, L-amino acid oxidase, trypsin inhibitor. Also, proteins from the venom of Elapids, Colubrids, Hydrophids, and lizards were identified. Venom of M. lebetina was studied with two dimensional gel electrophoresis for the first time. Also this is the first report of the whole snake venom mid-infrared FT-IR spectrum and the venom characterization with cluster analysis.