Caenorhabditis elegans oosit ve embriyolarında global mikroRNAom profillerinin analizi

Abstract

Pek çok organizmada oosit-embriyo geçişi transkripsiyon ve translasyon yokluğunda gerçekleşir. Dolayısı ile fertilizasyon ve erken embriyonik bölünmeler, oogenez sırasında sentezlenen ve olgun oositlerde depolanan maternal mRNA ve proteinlerle sağlanır. Erken embriyoda somatik blastomerlerin farklılaşması ve eşey hücre öncülü hücrelerin (germline) özelleşmesi için somatik blastomerlerden totipotensi programının silinmesi ve zigotik transkripsiyonun başlaması gerekir. Caenorhabditis elegans embriyosunda maternal proteinlerin somatik blastomerlerde nasıl yıkıldığı tanımlanmıştır (DeRenzo et al. 2003). Ancak C. elegans erken embriyosunda, maternal transkriptlerin somatik blastomerlerden nasıl uzaklaştırıldığı bilinmemektedir. Bu tez çalışmasında C. elegans germline ve erken embriyolarının ? zigotik genom aktivasyonu öncesi ve sonrası- miRNA profilleri yüksek işlem hacimli pirosekanslama ve miRNA mikroarray teknolojileri kullanılarak oluşturulmuştur. Böylece hem oosit-embriyo geçisinde rol oynayan miRNAlar tanımlanmaya çalışılmış hem de C. elegans erken embriyosunda maternal mRNA yıkımında mikroRNAların rolü olup olmadığının belirlenmesi amaçlanmıştır. Oositte ifade edilen miRNAlar (totipotensi ile ilişkili maternal miRNAlar), 2-blastomerli embriyoda ifade edilen miRNAlar (zigotik genom aktivasyonu öncesi), 8-blastomerli embriyoda ifade edilen miRNAlar (zigotik genom aktivasyonu sonrası) ve gastrulasyon öncesi erken evre karışık miRNAların ifade seviyeleri kıyaslanarak çarpıcı artış-azalış gösteren aday miRNAlar belirlenmiştir. PCR ile ifade seviyelerinin doğrulamasından sonra, biyoinformatik araçlar kullanılarak mikroRNAların hedeflediği mRNAlar tespit edilmiş ve yolak analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada tanımlanan miRNAların detaylı analizi, oosit-embriyo geçişi, erken embriyonik gelişimin düzenlenmesi, somatik blastomerlerin farklılaşması ve totipotentlik statüsünün idamesi gibi süreçlere ışık tutacaktır.

In many organisms, the transition from oocyte to embryo occurs in the absence of transcription and translation. Therefore, early developmental programs rely on maternal mRNAs and proteins which are synthesized during oogenesis and used during fertilization and early embryonic divisions. For an early embryo, it is vital to clear totipotency programme in the somatic blastomeres and start zygotic transcription in order to maintain proper embryonic development, differentiation of somatic lineages and germline specification. How maternal proteins are degraded in the somatic blastomeres of C. elegans embryos has been described (DeRenzo et al. 2003). In contrast, virtually nothing is known how maternal transcripts are cleared from the soma of early embryo in worms. By using high-throughput pyrosequencing and miRNA microarray technologies, miRNAs from C. elegans germline and early embryos -before and after zygotic genome activation- were sequenced and miRNAome profiles were generated in this thesis study. The aim of this study is to analyze the miRNAome profiles in C.elegans oocytes and early embryos and to determine whether microRNAs have role in maternal mRNA degradation in C.elegans in the early embriyo. Germline miRNAs (totipotency associated maternal miRNAs), 2-blastomere stage embryo miRNAs (before zygotic genome activation), 8-blastomere stage miRNAs (after zygotic genome activation), mixed stage miRNAs (before gastrula stage) were compared in order to identify differentially expressed miRNAs. After selection and PCR validation of the candidate miRNAs, downstream targets were identified by using bioinformatic tools and pathway analysis was performed. Further analysis of the identified miRNAs during this study will provide a better understanding of oocyte-embryo transition, regulation of early embryonic development, germline-soma differentiation and maintenance of totipotency status.