İmmunojen ASCT2 sekansının rekombinant protein üretimi ve poliklonal ASCT2 üretimi

Abstract

Biyoteknoloji alanında ve terapötik çalışmalarda son on beş yıldır, antikor üretim teknolojisi devrimsel gelişmelerin en önemlilerinden biri haline gelmiştir. Bu teknolojinin oluturulması için öncelikle saf, spesifik ve güvenli antijenlerin oluşturulması gerekmektedir. Rekombinant DNA teknolojisi istenilen özelliklere sahip antijenin üretilmesi için kullanılan en temel yöntemlerden bir tanesidir. Bu çalışmada glutaminin hücre içine alınmasında görevli amino asit taşıyıcı 2 proteini (ASCT2)'nin immunojenik molekülünün rekombinant DNA teknolojisi ile üretimi ve poliklonal ASCT2 antikor üretimi gerçekleştirilmiştir. Balb/C dişi farenin karın içinde oluşan 'ascites' ismi verilen sıvı toplanmış ve hedef antijene spesifik antikor üretildiğini göstermek için yapılan ascites sıvısı ve kuyruk veninden alınan serum örnekleri western blot deneylerinde primer antikor olarak kullanılmıştır. Ascites sıvısı ve serumun içindeki antikorların istenilen antijene bağlandığı tespit edilmiştir. Bir sonraki adımda fazla miktarda ascites örneğinin toplanıp antikor saflaştırma koşulları optimize edilecektir. Saflaştırılmış ASCT2 poliklanal antikorun yeterli donanıma sahip şirketlerde ELISA kiti oluşturulmasında kullanılmasını hedeflemenmektedir.Çalışmanın ikinci kısmında ise ASCT2 proteininin ifadelenmesinin karaciğer kanser hücre hattı (HepG2) ve obez/normal farelerden alınmış karaciğer ve yağ doku gruplarında regülasyonuaraştırılmıştır.HepG2 hücre hattında glutamin konsantrasyonu artırıldığında ASCT2 ifadelenmesinin arttığı gözlenmiştir. Obez farelerin karaciğer ve yağ dokularında ise normal faredekilere göre daha fazla ifadelenme olduğu saptanmıştır. Sonuç olarak, poliklonal antikor üretim teknolojisi başarılı bir şekilde uygulanmıştır ve laboratuvarda üretmiş olduğumuz poliklonal antikorları kullanarak ASCT2'nin obez farelerin karaciğer ve yağ dokularında daha fazla ifade edildiği gözlenmiştir.

Antibody production technology has been one of the greatest beneficiaries in biotechnology and therapeutic fields over the past 15 years. In order to get this technology, we need more highly purified, more specific, and safer antigens. Recombinant DNA technology is one basic method for the production of target antigens. In this study, immunogen sequence site of human amino acid transporter 2 (ASCT2), role in glutamine transport into the cell, was manufactured by recombinant DNA technology. In addition polyclonal ASCT2 antibody was produced. Intraperitonal liquid called ascites was collected from Balb/C female mice and serum obtained from mice tail veinand ascites liquid were used as primary antibody in western blot analysis to prove antibodies are specific to target antigen. It was shown that the antibodies in ascites liquid and serum bound to the ASCT2 antijen. In the next step, more amount of ascites samples will be obtainedand antibody purification conditions will be optimized. We planto develop ELISA kits working incorrelation with some companies. In the second part of this study, the regulation of ASCT2 protein was investigated in human hepatocellular carcinomacell line (HepG2)and liver and adipose tissue in obese/normal mice. As a result, we succeed anti human ASCT2 polyclonal antibody productionand the expression of ASCT2 in liver and adipose tissue of obese mice was more than in that of lean mice.