Ex Vivo granülositer koloni oluşturan insan göbek kordon kanı hücrelerinin kök hücre fenotip analizi

Abstract

İnsan göbek kordon kanı (KK) kaynaklı Hematopoietik kök hücre (HKH)'lerin klinik uygulama için yeterli niteliklere sahip olup olmadığını gösteren standart yöntemler mevcuttur. Akım sitometri yöntemi ile CD34+ hücre mutlak sayısı KK ünitesi seçimindeki HLA uyumundan sonraki seçim kriteridir. Fenotipik bir belirleyici olan CD34+ hücre sayısı kadar, bu hücre fraksiyonların ve işlevselliğinin ortaya konması, uzun dönem ve kısa dönem hücreleri tanımlamak için de kullanılmaktadır. Kök hücre dondurarak saklama sırasında ve eriterek çözme sonrası HKH kalite ve sayısının belirlenmesi de önemli bir gereksinimdir. KK HKH içeriğini belirlemeye yönelik işlevsel bir yöntem olan ex vivo koloni oluşturma (CFU-GM) testleri bu gereksinimleri karşılamaya yönelik olarak geliştirilmiştir. Hücre fraksiyonlarının işlevsel niteliklerini hızlı bir şekilde belirlemek için aldehit dehidrogenaz (ALDH) aktivite tayini yöntemi geliştirilmiştir. Bu tez çalışması ile KK hücrelerinde toplanmayı takiben kabul kriterlerini sağlayan taze örneklerde ve dondurup çözülme sonrası örneklerde çalışılan CFU-GM kapasitesi, akım sitometrik CD34+ ve ALDH aktivitesi arasındaki ilişkinin analizi hedeflenmiştir. Araştırmaya 35 KK örneği dahil edilmiş, tüm örneklerde bu üç parametre analiz edilmiştir. Örneklerin 30'u eritrosit ve plazma ayrıştırma işlemi sonrası; 5'i araştırmaya ayrılmış -196°C'de saklanma sonrası çözüldükten sonra çalışmaya dahil edilmiştir. Taze örneklerin ortalama hücre içeriği toplam çekirdekli hücre (TNC) (93,27 ± 30,1 x106/Ünite), CD34+ hücre (3,85 ± 2,55 x106/Ünite), ALDH pozitif (ALDH+) hücre (3,14 ± 2,55 x106/Ünite), CFU-GM sayısı (13,2 ± 9,81 x105/Ünite), CFU-GEMM sayısı (19,3 ± 13,65 x105/Ünite) ve dondurulup çözülmüş örneklerde, TNC (71,76 ± 29,77 x106/Ünite), CD34+ hücre (5,44 ± 5,08 x106/Ünite), ALDH+ hücre (2,9 ± 2,82 x106/Ünite) ,CFU-GM sayısı (6,18 ± 3,44 x106/Ünite) ve CFU-GEMM sayısı (4,57 ± 3,22 x106/Ünite) aktiveteleri analiz edilmiştir. Taze örneklerde CD34 ile CFU-GM (r=0,722 p<0,001) ve CFU-GEMM (r=0,723 p<0,001) arası ilişki ; ALDH ,CFU GM (r=0,624 p<0,001), CFU-GEMM (r=0,451 p=0,12) ve CD34 ile ALDH (r=0,670 p<0,01) arası ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur.

There are presently a few methods available in the scientific literature to determine sufficiency and qualification of the hematopoietic stem cells (HSC)'s extracted from human umbilical cord blood (UCB) to use in the clinical applications. Flow cytometry procedure to determine the absolute number of CD34+ cells is the main CB unit selection criterion after HLA matching. The number of CD34+ cells and subpopulations, is also being used to identify the cell functionality fraction of the evaluation of long term (LTR) and short term repopulating (STR) capacity. In stem cell banking the quality and number of HSC is also an important requirement. In order to determine functionality ex vivo colony forming, UCB HSC unit-glanulocyte macrophage (CFU-GM) tests have been developed as the main method which has strong engraftment prediction potential of the CB unit. One of the recent methods described for the rapid and accurate detection of functional CB cell fractions is ALDH activity measurement in CB cells. In this thesis, CB cells collected according of the following acceptance criteria CFU-GM capacity, flow cytometric enumaration of CD34+ cells and measurement of ALDH positivity has been targeted to analyze the relationship between them. 35 samples of UCB included in this study and analyzed in all the samples for the mentioned three parameters. 30 samples have been studied following erythrocyte and plasma separation; another 5 samples which were cryopreserved at -196 °C and used after thawing. The total number of nucleated cells of fresh samples (TNC) (93,27 ± 30,1 x106/Unit), CD34+ cell counts (3,85 ± 2,55 x106/Unit) ALDH positive (ALDH+) (3,14 ± 2,55 x106/Unit), CFU-GM (13,2 ± 9,81 x105/Unit), CFU-GEMM (19,3 ± 13,65 x105/Unit) and in freeze-thaw samples TNC (71,76 ± 29,77 x106/Unit), CD34+ (5,44 ± 5,08 x106/Unit), ALDH + (2,9 ± 2,82 x106/Unit ) ,CFU-GM (6,18 ± 3,44 x106/Unit) and CFU-GEMM (4,57 ± 3,22 x106/Unit) were analyzed. In fresh samples relationship between CFU-GM, CD34 (r = 0.722, p <0,001) and CFU-GEMM (r = 0,723, p <0,001) ALDH, CFU GM (r = 0,624, p <0,001), and the relation between CFU-GEMM (r = 0,451, p = 0,12) and CD34, ALDH (r = 0,670, p <0,01) were found to be statistically significant.