Erişkin fare ovaryumunda olası germline ve pluripotent kök hücrelerin araştırılması

Abstract

Üreme biyolojisinin klasik bilgilerine göre doğum sonrası (post-natal) dişi memelilerin ovaryumunda oosit sayısı sınırlıdır ve eğer oositler herhangi bir hastalık veya hasar nedeniyle kaybedilirse tekrar yenilenme olanağı yoktur. Ancak son 10 yılda erişkin memeli ovaryumunda yeni oosit ve folikül oluşumu ile ilgili çıkan araştırma sonuçları, bu bakış açısını tamamen değiştirmektedir. Buradan yola çıkarak tasarlanan tezde amaç, erişkin fare (8 haftalık BALB/c) ovaryumunda olası germline ve pluripotent kök hücrelerin varlığını tespit etmek ve yeniden oosit oluşması olasılığını araştırmaktır.Bu çalışmada, immünofloresan boyama sonucu ovaryum doku kesitlerinde farklı folikül aşamalarındaki oosit hücrelerinin çekirdek ve sitoplazmasında pluripotent (Oct-4, Nanog ve Sox2) ve germline kök hücre belirteçleri (DAZL ve DDX4/VASA) pozitif olarak tespit edilmiştir. Ovaryum hücre kültüründen elde edilen hücrelerin çekirdek ve sitoplazmasında da yukarıda belirtilen pluripotent ve germline kök hücre proteinlerinin ifadesi gözlenmiştir.Ovaryum hücre kültüründe oosite farklılaştırma sonucu morfolojik olarak oosite benzer hücrelerin oluştuğu ve bu hücrelerden bazılarında partenogenezin meydana geldiği gözlenmiş,bunun yanı sıra foliküle benzer yapıların oluştuğu da tespit edilmiştir.qRT-PCR analiz sonucu, Oct-4, Sox2, Nanog, DDX4 ve DAZL genlerinin ifadesi hem ovaryum dokusu hem de farklılaştırma öncesi hücre kültüründen elde edilen hücrelerde tespit edilmiştir. Ancak hücre kültüründe ovaryum dokusuna göre Oct-4, Sox2, DDX4 ve DAZL genlerinin ifadesi kayda değer ölçüde (p<0.05) düşerken Nanog geninin ifadesi yükselmiştir. Farklılaştırma sonucu, oosite farklılaşan hücrelerde oosite özgün genlerin ifade edildiği ve partenogenezin meydana geldiği hücrelerde ise pluripotent kök hücrelere özgün genlerin ifade edildiği RT-PCR analiz yöntemi ile gösterilmiştir.İmmunoblotlama analizi sonucu Oct-4, Sox2, Nanog, DDX4 ve DAZL proteinlerinin ifadesi hem ovaryum dokusu hem de farklılaştırma öncesi hücre kültüründen elde edilen hücrelerde tespit edilmiştir.Sonuç olarak bu çalışmada erişkin fare ovaryumunda pluripotent ve germline kök hücre özelliğine sahip hücrelerin varlığı tespit edilmiş, İn vitro koşullarda bu hücrelerden oosit ve folikül benzeri hücrelerin oluştuğu ve bazı oosit hücrelerinde partenogenezin meydana geldiği gözlenmiştir.

According to the classical knowledge of biology, in the ovary of female mammals there are a limited number of oocytes and there is no possibility of renewal if the oocytes are lost due to disease or injury. However, in the last 10 years, the results of studies about renewal and formation of oocytes and follicles in the adult mammalian ovary are lead to changing of this view completely.The aim of this thesis is demonstration of presence of putative germline and pluripotent stem cells and investigates the possibility of neo-oogenesis in the adult mouse (8 week-old BALB/c) ovary.Immunoflorescence staining of ovarian tissue sections revealed the presence of pluripotent stem cell (Oct-4, Nanog and Sox2) and germline stem cell (DAZL and DDX4/VASA) markers in the cytoplasm and nucleus of oocytes in different follicular stages. Presence of these proteins was also observed in the nucleus and cytoplasm of the cells that harvested from ovarian cell culture by immunoflorescence staining.In the ovary cell culture, oocyte differentiation process led to formation of morphologically oocyte-like cells and in some of these cells parthenogenesis was occurred. As a result of differentiation process formation of follicle-like structures was also observed.In the ovarian tissue and non-differentiated cells that harvested from cell culture, expression of the Oct-4, Sox2, Nanog, DDX4 and DAZL genes was demonstrated by qRT-PCR method. Nevertheless, in the harvested cells comparing ovarian tissue, despite the increased expression of Nanog, expression of Oct-4, Sox2, DAZL and DDX4 was decreased significantly (p<0.05). In the cells that differentiated into oocyte, expression of oocyte specific genes and in the parthenogenesis occurred cells, expression of pluripotent specific genes was demonstrated by RT-PCR method.As a result of western blot analysis, expression of Oct-4, Sox2, Nanog, DDX4 and DAZL proteins was observed in the ovarian tissue and non-differentiated cells that harvested from cell culture.Based on our study outputs, presence of pluripotent and germline stem cells in the adult mouse ovary was demonstrated. Under in vitro circumstances, differentiation potential of these cells into oocyte-like cells, follicle-like structures and in some cases parthenogenesis-like phenomena was observed.