Bir gen modeli olarak nötral lipozomların bivalan metal iyonları ile birlikte kullanımının incelenmesi

Abstract

Gen tedavileri; kalıtsal, otoimmün, immün sistemi baskılayıcı ve kanser hastalıklarınıniyileĢtirilmesinde kullanılmak üzere geliĢtirilen yöntemlerdir. Gen tedavisi amacıylakullanılan viral vektörlerin aktarmak üzere taĢıdıkları DNA‟yı hücreye taĢırken hedefleridıĢında olan hücreleri de enfekte edebilme, taĢıdıkları DNA‟yı konakçı genomunda entegreolmaması gereken bir bölgeye sokabilme gibi risklerinin bulunması nedeniyle gentedavisindeki kullanımları sınırlanmaktadır. Gen tedavisinin önündeki bu sınırlamayıkaldırmak üzere hücreye DNA aktarımında plazma membranından geçebilme özelliğinesahip olan lipid vesikülleri denenmektedir. Gen transferi için kullanılan ve lipidveziküllerininin nükleik asitlerle beraber oluĢturduğu nanobileĢenler, genozom veyalipopleks adını almaktadır. Günümüzde insan gen tedavisi ile ilgili araĢtırmalarda alınansonuçlar yalnızca tedavi edilmesi hedeflenen hücreye özgü gen aktarım araçlarıbulunmadığından henüz istenen verimde çalıĢmamaktadır. Lipid vesiküllerinin hücrelerinbulunduğu ortama verilmesinden gen ifadesine kadar giden yolda terapötik geni taĢıyanDNA‟yı degradasyondan koruyacak optimize edilmiĢ gen taĢıma sistemlerine ihtiyaçvardır. Yoğun olarak kullanılan katyonik lipitlerle yapılan lipofeksiyon deneyleri sıkçaistenmeyen sitotoksisiteye neden olabilmekte, kontrolü zor olan serum stabilitesineolumsuz etki edebilmekte ve tüm bu olumsuzluklar nedeniyle düĢük transfeksiyon oranlarıile sonuçlanmaktadır.Bu tez çalıĢmasında sitotoksik katyonik lipozomlar yerine, zwitteriyonik fosfolipitler, çiftdeğerli katyonlar (Mg+2 ve Ca+2) ile DNA bir araya getirilerek toplaĢımlar oluĢturulmuĢ vebu yapıların özellikleri ile kullanımları irdelenmiĢtir. Daha spesifik olarak çok katmanlı (MLV) ve tek katmanlı (ULV) fosfatidilkolin vezikülleri oluĢturulduktan sonra, çiftvalanslı metal katyonlarca tetiklenen DNA‟nın MLV ve ULV fosfatidilkolin vezikülleriüzerine adsorpsiyonu, agregasyonu ve adhezyonu UV/VIS spektroskopisi ile araĢtırılmıĢtır.Zwitteriyonik lipozomların termotropik faz değiĢimleri Mg+2 varlığında polinükleotitler veçeĢitli DNA‟lar ile bileĢik oluĢturmaları termodinamik ölçümler ve floresan mikroskopisiile incelenmiĢ ve çeĢitli elektrostatik lipit-nükleik asit bileĢiklerinin oluĢumları ile ilgilidaha önce yayınlanan verilerle kıyaslanmıĢtır. Bu Ģekilde oluĢan üçlü bileĢiklerin (DNA,lipid, Mg+2) yüzey tanınma ve sınırlararası özellikleri Langmuir-Blodgett tek katman,titreĢim (FTIR ve Raman) spektroskopisi ile araĢtırılmıĢtır. Bu genozomların boyut vemorfoloji analizleri z-potansiyel, Dinamik IĢın Saçılımı (DLS) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. ÜçlübileĢiklerin yapısal değiĢikleriyle ilgili termodinamik ve kinetik modellerin ortayakonmasına yönelik olarak Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik (DSC), TermogravimetrikAnaliz (TGA) ve Ġzotermal Titrasyon Kalorimetrik (ITC) ölçümleri yapılmıĢtır. Mg+2varlığında DNA ile lipozomlar arasında meydana gelen füzyon olayları ise floresan vekonfokal mikroskopisi ile incelenmiĢtir. Transfeksiyon için etkili dairesel ve süpersarmallıplazmidlerin oluĢumu agaroz jel elektroforez ile gösterilmiĢtir. Spektroskopik ölçümlerleüçlü bileĢenlerin yapılarında yer alan biyomakromoleküllerin ikincil yapılarındaki yapısaldeğiĢiklikler gösterilmiĢtir. Mikroskobik ölçümler sonucunda üçlü oluĢumlar görsel olaraktanımlanmıĢ, boyut-potansiyel ölçümleri sonucunda görsel olarak TEM ile belirlenensonuçlar teyit edilmiĢtir. Termal ölçümler ile biyodinamikleri ve oluĢum termodinamiğiparametreleri hesaplanmıĢtır. Ayrıca lipit/DNA/(Mg+2 ve Ca+2) üçlü kompleksinin hücreselsisteme aktarılması için transfeksiyon deneyleri yapılmıĢ; metal katyonlarca (Me+2)gerçekleĢtirilen transfeksiyon etkinlikleri incelenmiĢtir. Bu üçlü toplaĢımın Mg+2 ileyapılan kısmında transfeksiyon gerçekleĢmiĢ ancak deney tekrarlanamamıĢtır.Lipit/DNA/Ca+2 ile transfeksiyon ise başarılı olmuştur.

Gene therapies are developed for curing inherited, autoimmune, immune systemsuppressive and cancer diseases. The use of viral vectors in gene therapy is limited becauseviral vectors have the risk to infect cells other than targeted ones and the DNA they carrycan integrate into an undesirable locus in the host genome . In order to overcome theselimitations of gene therapy lipid vesicles capable to transfer DNA across cellular plasmamembrane are being tested. Lipid vesicles used in gene transfer and the nanocomplexesthey formed with nucleic acids are referred to as genosomes or lipoplexes. Nowadays, theresults obtained in the field of human gene therapy are unsatisfactory, due to the lack ofselective tools towards the targeted cells. There is a need for optimized lipid vesicle basedgene carrying systems protecting the DNA from degradation throughout their routes fromthe application site to gene expression. Lipofection experiments undertaken with widelyused cationic lipids frequently lead to undesired cytotoxicity and has negative effec t onserum stability. Thus their transfection rates are low.In this thesis the use of zwitterionic phospholipids, forming assemblies with divalent metalcations (Ca2+ and Mg2+) with DNA and the potential use of these structures wereinvestigated. More specifically, upon multilamellar (MLV) and unilamellar (ULV)phosphatidylcholine vesicle formations, the DNA adsorption, aggregation and adhesiononto these vesicles, triggered by divalent metal cations, were analyzed by UV/VISspectroscopy. The thermotropic phase transitions, the complex formations between polynucleotides andvarious DNA in the presence of Mg2+ were studied by thermodynamic measurements andfluorescence microscopy. The results were compared to previously reported electrostaticlipid-nucleic acid formations. The surface recognition and interfacial properties of theformed ternary complexes (DNA/lipid/Mg2+) were investigated by Langmuir-Blodgettmonolayers and vibrational (FTIR and Raman) spectroscopy. Size and morphologyanalyses of these genosomes were undertaken by z-potential and Dynamic Light Scattering(DLS) measurements. Thermodynamic and kinetic models concerning structural changesof ternary complexes were built based on Differential Scanning Calorimetry (DSC),Thermogravymetric Analysis (TGA) and Isothermal Titration Calorimetry (ITC). Fusionevents occuring between DNA and liposomes in the presence of Mg2+ were analyzed byfluoresence and confocal microscopies. Transfection competent circular and supercoiledplasmid formations were shown by agarose gel electrophoresis. Secondary structuralchanges of biomacromolecules engaged in ternary complex formations were shown byspectroscopic measurements. Ternary formations were depicted visually by microscopicmeasurements and the obtained results on their sizes were verified by TransmissionElectron Microscopy (TEM). Their biodynamical features and formation thermodynamicparameters were estimated by thermal measurements. Moreover, the cellular transfers oflipid/DNA/(Mg2+ and Ca2+) ternary complexes were analyzed by transfection experimentsand the transfection efficiencies trigerred by metal cations (Me2+) were determined.Transfection studies based on these ternary complexes and Mg2+ were accomplished butthese results cannot reproduced. Transfections based on lipid/DNA/Ca2+ system weresuccessful.