Rekombinant insan interferon gama peptidinin bakteri ekspresyon sistemleri kullanarak üretimi

Abstract

İnterferon gama (IFN-γ), hücre-içi bakteriyel ve viral enfeksiyonlara karşı ve tümör kontrolunde doğustan ve kazanılmış bağışık yanıtta oldukça etkili olan aynı zamanda bağışık yanıtı düzenleyici fonksiyonları bulunan tip-2 interferon sınıfında yer alan sitokindir. Bu sitokin ağırlıklı olarak bağışık yanıt hücreleri olan NK hücreleri, T hücreleri, B hücreleri ve makrofajlar üzerindeki düzenleyici etkisi ile bilinmektedir. Özellikle IFN-γ pozitif geri bildirim mekanızmasıyla Th0 hücrelerinin Th1'e farklılaşmasını destekleyerek kendi salınımını artırmaktadır. Bu durum IFN-γ nın bağışık yanıt düzenleyici özelliği ile kilit bir molekül olduğunu göstermektedir. IFN-γ ile yapılan sayısız klinik çalışmalarda kanser, tüberküloz, kronik granülomatoz ve osteopetrosiz tedavisinde oldukça etkili bir terapötik ajan olduğunu göstermiştir.Bu tez çalışmasında, IFN-γ nın terapötik ajan olarak kullanımındaki olumlu etkileri göz önünde bulundurulduğunda bakteri üretici sistemleri kullanılarak endüstrinin talep ettiği bu ve benzeri rekombinant protein üretim süreçlerinin iyileştirilmesi ve kaliteli rekombinant peptid üretimi hedeflenmiştir. Bu amaçla, üretimi hedeflenen insan İnterferon Gama geninin tüm sekansını kodlayan vektörler oluşturulmuştur. Bu vektörler aracılığla elimizde bulunan prokaryotik üretici sistem; Escherichia coli K12-JM109 ve BL21 (DE3) ile hedef protein üretimi istatiksel deneysel yaklaşım olan deney tasarım yöntemleriyle kapsamlı çalışmalar yapılmış ve saflaştırma yöntemleri optimize edilmiştir. Son olarak, prokaryotik üretici sistemden elde edilip saflaştırılan rekombinant insan IFN-γ proteini etkinlik deneyi amacıyla IFN-γ ile muamele edilmiş SH-SY5Y insan nöroblastom hücre hattı kullanarak süpernatantlardaki C1q düzeyleri sandviç ELISA tekniği ile tayin edilmiş aynı zamanda MTT testi uygulanmıştır.

Interferon-γ (IFN-γ) is the only member of type II class interferon with antimirobial, immunoregulatory and anti-tumor activities during innate and adaptive immune response. This cytokine has well known promoting effect on NK cells, T-cells, B-cells and macrophages. IFN-γ favor Th1 differentiation from un differentiated Th0 cells, which in turn cause more IFN-γ secretion in a positive feedback manner. IFN-γ has been shown to be a key immunoregulatory molecule. There are numerous studies that IFN-γ has been used in various clinical indications including cancer, tuberculosis, hepatits, chronic granulomatous disease, osteopetrosis, scleroderma as an effective theropeutic agent.In this study, when considering IFN-γ positive effects in the use as therapeutic agents we aim to improve recombinant protein production processes and produce quality recombinant protein demanded in the bio-tech/pharmaceutical industry by the use of bacterial expression systems. For this purpose, we design and construct an expression plasmid encoding full coding sequence of IFN-γ and optimize the expression and purification conditions. In order to determine optimized protein production in Escherichia coli K12-JM109 and BL21 (DE3) as a prokaryotic expression system and purification techniques the experimental design techniques are applied.We conduct activity assay in IFN-γ treated SH-SY5Y human neuroblast cell line. After collecting culture supernatant, C1q level is measured by using sandwich ELISA (also called direct ELISA). Also MTT assay is used for the detection of healthy cells and the measure of metabolic activity.