Mikrobiyal hyaluronik asit üretimi ve saflaştırılması

Abstract

Hyaluronik asit (HA) yüksek molekül ağırlıklı bir glikozaminoglikan polimeridir, molekül ağırlığı onun fizyolojik rolünü, reolojik özelliklerini ve bunlara bağlı olarak uygulama alanlarını belirlemektedir. HA, rutin olarak hem Grup A hem de Grup C Streptococcus türlerinin fermantasyonu ile üretilmektedir. Günümüz biyoteknoloji alanı içerisinde hyaluronik asit oldukça önemli bir yere sahiptir. HA' nın farklı formulasyonları ve moleküler ağırlıkları; oftalmoloji, ortopedik cerrahiler, rejenerasyon sürecinin hızlandırılması ve desteklenmesi gibi alanlar başta olmak üzere tıpta ve günümüzde oldukça yüksek bir pazar payına sahip olan kozmetik sektöründe yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında, Streptococcus equi (S.equi) (9682) mikroorganizması kullanılarak HA üretimi, saflaştırılması, immünojenite ve toksikolojik analizlerin yapılması amaçlanmıştır. Mikrobiyal üretimde optimum koşulların belirlenebilmesi amacıyla, farklı çalkalama hızları, pH değerleri, inkübasyon sıcaklıkları, inokulum ve sukroz konsantrasyonları denenmiştir. Ardından kültür sıvısından ekstraksiyon yöntemi ile HA elde edilmiştir. Elde edilen HA çözeltisine farklı moleküler boyutlardaki diyaliz membranları uygulanarak, saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen ve ticari olarak satılan farklı moleküler ağırlıklardaki HA' nın fare deri fibroblast (L929, ATCC) hücre dizisi kullanılarak in vitro hücre canlılık değerlendirmesi (MTT testi) yapılmış ve biyouyumluluk değerlendirmesi için insan monositik hücre dizisi (THP-1, ATCC) makrofaja, phorbol-12-miristat-13-asetat (PMA) uygulaması ile farklılaştırılarak elde edilen HA makrofaj hücrelerine uygulanmış ve immünolojik yanıt oluşturup oluşturmadığı proinflamatuar sitokinlerden tümör nekroze edici faktör (TNF-α), interlökin-8 (IL-8) ve anti-inflamatuar sitokin interlökin-10 (IL-10) sekresyon düzeyleri belirlenerek değerlendirilmiştir. Çalışma kapsamında, üretilen HA' nın, ticari olarak alınan HA ile aynı immünolojik yanıtı vermiş olduğu gözlenmiştir.

Hyaluronic acid (HA) is a linear high molecular weight glycosaminoglycan polymer with its molecular weight determining its physiological role, rheological properties and applications. HA is routinely produced through fermentation of both Group A and C streptococci. Today, HA has a very important place in the biotechnology field. HA is used due to its different formulations and molecular weights in ophthalmology, orthopedic surgery, accelerating the process of regeneration and support, especially in commercial medicine and in cosmetic industry in which is widely used and has a very big market today. In this thesis, Streptococcus equi (S.equi) (9682) was used for the microbial production process and then, purification, immunological and toxicological processes were applied to it which was obtained by S.equi. To obtain the optimum conditions of microbial production, different shaking rates, pH values, temperatures, inoculum and sucrose concentrations were applied to culture process. Next, HA was extracted from fermentation culture. And then, HA was purified with using dialysis membranes which have different molecular weight cut-off (MWCO). Mouse fibroblast cells (L929, ATCC) were used for toxicity test (MTT) to evaluate in vitro cell viability of the obtained and purchased HA and human monocytes (THP-1) cell line which were differentiated to macrophage cells by phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), were used for biocompatibility tests to evaluate tumor necrosis factor (TNF-α), interleukin-8 (IL-8) and interleukin-10 (IL-10) cytokines secretion of them for immunological respond. And, the produced and commercial HA gave the same immunological results on these tests.