Mutant parkin proteininin moleküler karakterizasyonu ve nöroblastoma hücre proteomu üzerindeki etkisi

Abstract

Nörodejeneratif hastalıklar arasında Parkinson Hastalığı (PH) dünya genelinde Alzheimer hastalığından sonra en sık görülen ikinci hastalıktır. Hem genetik (belirlenen 18 gen lokusu) hem de çevresel (MPTP, paraquat, rotenone, 6-Hidroksidopamine) faktörlerin etkili olduğu PH'da en önemli patofizyolojik özellik beyindeki substantia nigra pars kompakta bölgesindeki dopaminerjik nöronların kaybıdır. Bu bölgedeki dopaminerjik nöronların % 60'ının kaybı ile hastalığın klinik semptomları ortaya çıkmaktadır. Klinik tabloda karşılaşılan klasik bulgular tremor, rijidite, portural instabilite ve hareketlerde kısıtlılıktır. Ancak PH'da karşılaşılan klinik tablo bazen kesin klinik tanı koyabilmek için yeterli olmayabilir. Bundan dolayı PH ile ilişkili yapılan araştırmaların bir kısmı özerkliği ve duyarlılığı yüksek biyobelirteçler üzerinedir. Biyobelirteçler hastalık henüz klinik olarak kendisini göstermeden tanı koymaya ve erken teşhis ile tedavinin veriminin artmasını sağlayacak moleküllerdir. Biyobelirteçlerin belirlenmesi için kullanılan yaklaşımların başında proteomiks gelmektedir. Proteomiks yaklaşımlar ile hücrenin tüm protein profili incelenebilmekte ve hastalıklar ile ilişkili proteinler belirlenebilmektedir. Bu çalışmada erken başlayan PH'ya sebep olabilen Parkin proteinine ait iki mutasyonun (Q311R ve A371T) nöroblastoma hücre proteomu üzerine etkisi araştırılmıştır. Çalışmalar sırasında elde edilen verileri karşılaştırabilmek için yabani tip Parkin proteini kontrol olarak kullanılmıştır. Bulgular mutant Parkin proteininin E3 ubikuitin ligaz aktivitesini kaybetmeden yabani tip Parkin proteinine göre hücrenin nükleusunda daha fazla konumlandığını, hücre içerisinde parçalanmadan daha uzun süre kaldığını, hücre tarafından farklı şekilde translasyon sonrası değişimlere tabi tutulduğunu ve hücre proteomunu farklı şekilde etkilediğini göstermiştir. Özellikle mutant Parkin protein ekspresyonu hücreyi strese sokarak şaperon protein sentezini arttırmaktadır. Ayrıca bulunan ekspresyonu değişmiş bazı proteinlerin literatürde daha önceden PH ile ilişkisinin bilinmiş olması yaptığımız çalışmanın ve elde edilen verilerin mantıksallığını doğrulamıştır. Bugüne kadar çalışılmamış olan ancak önem içerdiğine inandığımız sinyal yolakları ve bunların PH ile olan ilişkisi bu çalışma kapsamında fosfoproteom yönünden incelenmiştir. PH oluşumunda potansiyel etkilerinin olabileceği 13 fosforillenmiş protein belirlenmiştir.

Parkinson?s Disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease encountered after Alzheimer disease around the world. The most important pathophysiologic feature of PD, to which both genetic (indicated 18 gene locus) and environmental (MPTP, paraquat, rotenone, 6-Hidroksidopamine) factors effect, is the loss of dopaminergic neurons in substantia nigra pars compacta of the brain. Clinical symptoms of PD occur after 60 % of the dopaminergic neurons are lost of in substantia nigra pars compacta. The most comman clinical features of PD includes tremor, rigidity, bradykinesia and postural instability. However these common features are not sufficient indicators to diagnose PD in full accuracy. Therefore, to aid accurate diagnosis of PD some of the research for PD focuses on finding of highly specific and sensitive biomarkers. Biomarkers are molecules that improve affectiveness of the treatment by helping early diagnosis before the disease appears. Proteomics is one of the main approaches to identify biomarkers. By proteomics approach, protein profile of a cell can be visiulized, characterized and quantitative changes in expression patterns can be identified. The purpose of this PhD thesis was to characterize a mutant Parkin protein (Q311R and A371T) and study the effect of observed mutations on parkin activity, stability, localization and neuroblastoma cell proteome. Wild type Parkin protein was used as the control for comparison. The findings indicated that mutant Parkin protein carried E3 ubiquitin ligase activity, localized more in the cell nucleus, was much more stable, possessed a post translational modification and displayed a pronounced effect on cell proteome in comparison to wild type Parkin protein. Specifically speaking mutant Parkin protein expression caused an increased cell stress and induced expression of chaperon proteins. Some of the identified proteins were found to be previously identified PD related proteins. Reidentification of these proteins during this study confirmed the accuracy of our approaches and findings. So far, signalling pathways and their role in PD formation have not been scrutinized. During the study we investigated the changes in phosphoproteome by using phosphoproteomic approaches. 13 proteins that are being phosphorylated were identified as being potential affectors of PD formation.