Meme kanseri tedavisine yönelik Usnik Asit`e cevap veren miR-185-5p`nin apoptoz yolağı üzerindeki etkisinin moleküler düzeyde araştırılması

Abstract

Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanser tipidir. Heterojen bir yapıya sahip olan meme kanseri birçok alt tipte sınıflandırılmaktadır ve tedavi süreci de bu alt tiplere göre düzenlenmektedir. Günümüzde meme kanserinin tedavi sürecinde birçok farklı kimyasal kökenli ilaç kullanılmaktadır fakat zaman içerisinde hastalarda bu ilaçlara karşı direnç oluşumu gözlemlenmektedir. Kimyasal olarak sentezlenen ilaçlardan farklı olarak sentetik moleküller, RNAi tabanlı özellikle miRNA gibi terapötikler veya biyolojik kökenli alternatif ilaç aday moleküllerinin tedavideki etkinlikleri araştırılmaktadır. Doğada biyolojik organizmalardan biri olarak bilinen likenlerden izole edilen usnik asit sekonder metabolitinin de meme kanseri tedavisine olan etkisi mikroRNA seviyesinde daha önceki çalışmada belirlenmiştir. Yapılan çalışmada usnik asitin 3 adet farklı histolojik kökenli meme kanseri hücresine uygulanması sonucu ifadesi değişen mikroRNA'lar belirlenmiştir. miR-185-5p gerçekleştirilen qRT-PCR yöntemine dayalı validasyon çalışmaları sonucu güvenilirliği istatistiksel olarak doğrulanan miRNA olup etkinliğini BT-474 hücre hattında gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca miR-185-5p'nin apoptoz yolağında etkin olabileceği biyoinformatik araçlar vasıtasıyla doğrulanmıştır.Bu tez çalışmasında meme kanseri tedavisine yönelik usnik asite yanıt oluşturan miR-185-5p'nin apoptoz yolağı üzerindeki etkisi moleküler düzeyde incelenmiştir. Hücre apoptoz oranını belirlemek ve hücre döngüsü analizlerini tamamlamak amacıyla akış sitometrisi cihazı, apoptoz yolağındaki etkili gen ifade seviyelerinin belirlenmesinde qRT-PCR yöntemi kullanılırken miR-185-5p'nin BT-474 hücresindeki hedefinin belirlenmesinde ise western blot ve lusiferaz deneyi kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar miR-185-5p'nin apoptoz ilişkili genlerin ifade seviyelerinde önemli oranda değişime neden olduğu ve hücrenin apoptotik sürece girmesini indüklediği anlaşılmıştır. Ayrıca miR-185-5p'nin BT-474 hücresi içerisinde direk olarak 3'UTR BCL2 dizisini hedeflediği ve böylece BCL2 proteini seviyesinde azalmaya neden olduğu western blot yöntemi ile doğrulanmıştır. Elde edilen sonuçlara göre miR-185-5p'nin BT-474 hücresi içerisinde tümör baskılayıcı rol oynadığı gösterilmiştir. Tez kapsamında, miR-185-5p'nin meme kanseri tedavisinde etkili bir ajan olabileceği gösterilmiş olup, gelecekte yapılacak klinik çalışmalar ile doğrulanması durumunda da miR-185-5p meme kanseri tedavisinde kullanılabilecek bir molekül olabileceği ortaya çıkarılmıştır.

Breast cancer is the most common cancer types in woman. Breast cancer which is considerably heterogenous in terms of phenotypic features is classified into several subtypes, therefore treatment of breast cancer is regulated with respect to these subtypes. Nowadays, many chemical drugs are utilized for the treatment of breast cancer; however, after a while, resistance to these drugs is observed in patients. Unlike chemically synthesized drugs, the efficiency of synthetic molecules, RNAi based therapeutics, especially microRNAs, or biological origin alternative drug candidate molecules in cancer treatment have been investigated. The effect of usnic acid isolated from lichens that are known as biological organism in nature on breast cancer treatment was investigated at molecular (microRNA) level in the previous studies. In this previous study, after Usnic acid was applied to 3 histologically different breast cancer cell lines, microRNAs with changing expression levels was identified. The validation of miR-185-5p was confirmed based on qRT-PCR method and the efficiency of miR-185-5p was determined in BT-474 cell line. In addition, it is confirmed by bioinformatic tools that miR-185-5p can be effective in apoptosis pathway. In this thesis, the effect of usnic acid responsive mir-185-5p in breast cancer treatment on apoptosis pathway was investigated at molecular level. Flow cytometry was used to determine the apoptosis ratio and analyze the cell cycle. The apoptosis related genes expression analysis was performed by qRT-PCR and the direct target of miR-185-5p in BT-474 cells was identified by western blot and luciferase reporter assay. Our data showed that miR-185-5p can cause significant changes in apoptosis related genes expression levels, suggesting that cell proliferation was suppressed by miR-185-5p via inducing apoptosis in breast cancer cells. According to western blot results, miR-185-5p lead to decrease BCL2 protein level in BT-474 cells and direct target of miR-185-5p was identified as 3'UTR BCL2 by luciferase reporter assay. Taken together, miR-185-5p could play a role as tumor suppressor in BT-474 cells. In this thesis, it is shown that miR-185-5p may be an effective agent in the treatment of breast cancer and miR-185-5p is promising to be a molecule that can be used in the treatment of breast cancer if it is confirmed by future clinical studies.