Nisin bakteriyosininin ve p-coumaric asitin enterococcus cinsinin quorum-sensing mekanizmasının inhibisyonuna ve virülans faktörlere etkisinin araştırılması

Abstract

Bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde kontrolsüz antibiyotik kullanımı, çoklu ilaç dirençli suşların ortaya çıkmasına sebep olmaktadır. Bakterilerin neden olduğu enfeksiyonların çoğu biyofilm yapısı ile ilişkilidir ve bu yapının oluşmasına quorum sensing (QS) adı verilen mekanizma aracılık etmektedir. Bu çalışmada, nisin ve p-coumaric asitin (pCA) tek başlarına ve kombine halde uygulanmasının fırsatçı bir patojen olan Enterococcus faecalis türündeki 3 suşta (74, 114 ve OG1RF) AI-2 aracılıklı QS mekanizmasına ve çeşitli virülans faktörlere etkileri belirlenmiştir. Böylece, bu organizma ile mücadelede antibiyotik kullanımına alternatif olabilecek AI-2' yi hedef alan yeni bir stratejinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun için öncelikle test edilen ajanların MİK değerleri belirlenmiştir. Ardından, her suşun eksponansiyel fazdaki planktonik formlarından izole edilen süpernatantlarına MİK dozlarında nisin (OG1RF için 0,5 mg/ml; 74 ve 144 için ise 0,25 mg/ml), pCA (üç suş için de 1 mg/ml) ve nisin+pCA kombinasyonu uygulanmıştır. AI-2 aktivitesindeki değişimlerin hesaplanmasında raportör suş Vibrio harveyi'den yararlanılmıştır. AI-2 aktivitesi üzerinde en yüksek inhibisyon etkisini tek başına pCA gösterirken (%60-66), nisinin tek başına istatistiki olarak anlamlı bir etkisi belirlenmemiştir. İki ajanın birlikte uygulanması sonucunda ise, etkinlikte bir artış gözlenmemiştir. Ajanların E. faecalis biyofilm oluşumu üzerine etkilerinin belirlenmesi amacıyla, E. faecalis gelişme ortamlarına ajanlar MİK dozlarında (0,25 veya 0,5mg/ml nisin ve 1 mg/ml pCA) hem tek başlarına hem de kombine halde ilave edilmiştir. 24 h ve 48 h'lik inkübasyon sonrasında biyofilm oluşum düzeylerindeki farklılıklar canlı hücre sayısı belirlenmek suretiyle incelenmiştir. Nisin tek başına uygulandığında tüm suşların biyofilm oluşumunu ≤%11 oranında azaltırken, pCA uygulamasıyla biyofilm oluşumunda % 10-17 arasında azalma tespit edilmiştir. İki ajanın birlikte uygulanmasının, 24 h ve 48 h'lik inkübasyon sonucunda OG1RF suşunun biyofilm oluşumunu tamamen engellediği, 114 ve 74 suşunda 24 h' te sırasıyla inhibisyon oranın %30 ve %15; 48 h' te ise %26 ve %16 oranında olduğu belirlenmiştir. Ajanların virülans genlerin ifadesi üzerine etkilerinin araştırıldığı çalışmalar sonucunda, nisin ve nisin+pCA kombinasyonunun sprE geni üzerinde 30-40 kat düzeyinde inhibisyon etkisi gösterdiği belirlenmiştir. Yalnızca pCA ajanının ise sprE geninin ifadesinde değişime neden olmadığı bulunmuştur. Bununla birlikte test edilen koşullarda ace ve gelE genlerinin suşlarda ifade edilmediği belirlenmiştir. Denemelerimiz ile nisin ve pCA' nın E. faecalis AI-2 sinyal molekülü inhibisyonu hem de biyofilm oluşumu üzerindeki etkileri lirteratürde ilk kez araştırılmıştır. pCA tek başına AI-2 inhibisyonu üzerinde anlamlı düzeyde etkili bulunurken, nisin ve pCA'nın birlikte kullanılması halinde E. faecalis suşlarının biyofilm oluşumu anlamlı düzeyde azalmış/engellenmiştir. Elde ettiğimiz bulgular, bu iki ajanın fırsatçı patojen E. faecalis ile mücadelede önemli ajanlar olabileceğini ortaya koymaktadır.

Uncontrolled use of antibiotics in the treatment of bacterial infections leads to the emergence of multi-drug resistant strains. Most of the infections caused by bacteria are related to the structure of the biofilm and this structure occurs as a result of the communication of bacteria through the mechanism called quorum sensing (QS). In this study, determination of the effects of nisin and p-coumaric acid and the combination of these two agents on AI-2 QS mechanism and various virulence factors in 3 strains (74, 114 and OG1RF) of Enterococcus faecalis, an opportunistic pathogen, were investigated. Thus, it is aimed to determine a new strategy targeting AI-2 which may be an alternative to antibiotic use in the fight against this organism. For this, the MIC values of the tested agents were determined first. Subsequently, to the supernatants, isolated from planktonic forms of each strain in the exponential phase, at MIC doses of nisin (0.5 mg / ml for OG1RF; 0.25 mg / ml for 74 and 144), pCA (1 mg / ml for all three strains) and nisin + pCA combination was applied. Reporter strain Vibrio herveyi was used to calculate the changes in AI-2 activity. While pCA alone (60-66 %) showed the highest inhibition effect on AI-2 activity, it was not determined that nisin had a statistically significant effect alone. As a result of the application of the two agents together, no increase in effectiveness was observed. In order to determine the effects of agents on E. faecalis biofilm formation, agents were added to E. faecalis growth media both at the MIC doses (0.25 or 0.5mg / ml nisin and 1 mg / ml pCA) individually and in combination. After 24h and 48h incubation, the differences in biofilm formation levels were examined by determining the number of live cells. When nisin was applied alone, all strains reduced biofilm formation by ≤11%, whereas pCA application reduced biofilm formation by 10-17 %. In combination with the two agents, the OG1RF strain completely prevented the formation of biofilms as a result of the incubation of 24h and 48h, 114 and 74 strains, the rate of inhibition at 24h was 30 % and 15 %; at 48h, 26 % and 16 % inhibition was observed respectively. As a result of studies investigating the effects of agents on the expression of virulence genes, nisin and the combination of nisin + pCA showed an inhibition effect of 30-40 times on the sprE gene. The pCA agent was found to cause no change in the expression of the sprE gene. However, it was determined that ace and gelE genes were not expressed in strains under the tested conditions. With our experiments, the effects of nisin and pCA on E. faecalis AI-2 signal molecule inhibition and biofilm formation were investigated for the first time in the literature. While pCA was found to have a significant effect on AI-2 inhibition alone, biofilm formation of E. faecalis strains was significantly reduced / inhibited when nisin and pCA were used together. Our findings reveal that these two agents may be important agents in the fight against opportunistic pathogen E. faecalis.