Sperm parametreleri ile sperm DNA fragmantasyonu ve kromozom anomalilerinin karşılaştırılması

Abstract

Erkek faktörlü infertil hastalarda, gizli sperm defektlerinin belirlenmesi hala başarısızdır. Erkek faktörlü infertilite hastalarının yaklaşık %15' i normal spermiyogram göstermektedirler. Semen örneğinin sperm DNA bütünlüğü, üreme etkinliği için çok önemlidir. Semen analizinin konvensiyonel parametreleri olan morfoloji, motilite ve örnekteki spermatozoa konsantrasyonu; üreme potansiyelinin değerlendirilmesi açısından yetersiz kalmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar sperm DNA yapısındaki defektlerin erkek infertilitesinin %20' sinden sorumlu olduğunu göstermiştir. Bu durum yardımcı üreme teknikleri açısından özellikle önemlidir. Rutin semen analizleriyle karşılaştırıldığında DNA apoptozis ve fragmantasyonunun incelenmesi tanısal ve prognostik olarak daha belirleyicidir. DNA hasarlı spermatozoon oranı arttıkça doğal yolla gebe kalma şansı da azalmaktadır. Yüksek oranda DNA hasarlı spermatozoon bulunan ejakulattan alınan spermatozoa' nın, IUI (intra uterin inseminasyon), IVF (in vitro fertilizasyon) ve ICSI (intra sitoplazmik sperm enjeksiyonu)'da da soruna neden olduğunu gösteren çalısmalar bulunmaktadır.Çalışmamızın amacı; rutin semen analizleriyle, sperm DNA' sındaki hasarın gösterilmesinin yeterli olmaması, ayrıca WHO kriterlerine göre sağlıklı olarak nitelendirilen sperm örneklerinin gerçek anlamda sağlıklı olup olmadığını belirlemek ve sperm DNA hasarlarının gösterilmesinde ileri tekniklerin rutin olarak kullanılmasının gerekliliğini vurgulamaktır.Çalışmamızda Kocaeli Tıp Fakültesi Tüp Bebek Merkezine çeşitli infertilite nedenleriyle başvuruda bulunan teratozoospermik, astenozoospermik ve normozoospermik vakaların semen örnekleri kullanıldı. Kruger kriterlerine göre morflojisi ≤ %4 olanlar teratozoospermi,WHO kriterlerine göre motilitesi %40'ın altında olan vakalarda astenozoospermi olarak kabul edilmiştir. Motolitesi % 40' ın üzerinde olan ve morfolojisi > %14 olanlar ise normozoospermi olarak çalışmaya dahil edilmiştir (WHO, 2010).Bu işlemi takiben sperm örnekleri Tunel, İmmünhistokimya, Western-Blot ve Fish analizleri yapmak üzere prosedürler uygulandı. İmmünhistokimya, İmmünofloresan ve Western-Blot yöntemi ile sperm sentrozom yapısındaki iki önemli protein olan Tubilin ve Sentrin' in varlığına bakılacaktır. Fish analizleri ile X, Y, 13, 18 ve 21 kromozomlardaki anomaliler incelenecektir. Spermlerdeki hasarın kromozom açısından kontrol edilecektir.Çalışmamızda önemle üzerinde durulmasını istediğimiz durum sperm anöploidili oranının normozoospermik kontrol grubundada önemsenecek değerlerde olduğunu göstermekti. Normozoospermik gruptaki apoptozis oranı % 9,1 ve FİSH analizlerinde Nullizomi(18,21), Monozomi (X,Y,13,18,21), Dizomi(X,Y,18,21) ve Trizomi 13 anöploidi frekansları astenozospermik ve teratozoospermik gruplarla istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermemesine rağmen, bu analizlerde diğer iki gruba yakın anöploidi frekanslarına sahiptir. Bu spermlerle yapılan YÜT uygulamalarıda normal kabul edilen sperm örneklerinin erkek faktörü olarak kabul edilen teratospermi, astenospermi, azospermi gibi sperm örnekleri kadar dikkat edilmesi gerekliliğini ortaya koymaktadır.

It is still difficult to determine hidden sperm defects in infertile patients with male factor etiology. Around 15% of infertile patients with male factor etiology still present with normal spermiogram test. DNA integrity of sperm sample is very important for reproductive efficiency. Morphology, motility and spermatozoa concentration, that are conventional parameters of semen analysis, remains insufficient for the assessment of reproductive potential. Recent studies have shown that defects in DNA structure are responsible for 20% of male infertility. This condition is very crucial for assisted reproduction techniques. When compared with routine semen analysis, assessment of DNA apoptosis and fragmentation are diagnostic and prognostic determining factors.The chance of spontaneous pregnancy decreases as the rate of spermatozoa with DNA damage increases. There are some studies showing spermatozoa obtained from the ejaculate containing high levels of DNA-damaged sperm cause problems in IUI (intrauterine insemination), IVF (in vitro fertilization) and ICSI (intracytoplasmic sperm injection).The aim of our study is to determine whether sperm samples that are considered as healthy according to WHO criteria are really healthy or not, and to emphasize the requirement for the routine use of advanced techniques in demonstration of sperm DNA damage. Semen samples from teratozoospermic, asthenozoospermic and normozoospermic cases who admitted to Kocaeli University Faculty of Medicine IVF Unit for various infertility reasons were included in our study. Patients whose sperm morphology is equal and less than 4% according to Kruger criteria were considered as teratozoospermia, and whose sperm motility was less than 40% were accepted as asthenozospermia according to WHO criteria. Patients whose sperm motility is more than 40% and morphology is above 14% were included in the study as normozoospermia (WHO,2010). Sperm samples were then underwent Tunnel, Immunohistochemistry, Western-Blot and Fish analyses. The presence of two important proteins of centrosome structure, Tubulin and Centrin, was examined by Immunohistochemistry, Immunofluorescence and Western-Blot methods. Abnormalities in chromosomes X, Y, 13,18 and 21 were investigated by FISH analysis. The damage in the chromosomes of spermatozoa will be controlled.The main condition that we want to focus in our study is to show that the rate of sperm aneuploidy in normozoopermic control group is also at a substantial level. Apoptosis rate in normozoospermic group was found to be 9.1%. Although the aneuploidy frequencies of Nullisomy (18, 21), Monosomy (X, Y, 13, 18, 21), Disomy (X, Y, 18, 21) and Trisomy 13 in control group did not show a statistically significant difference compared to asthenozoospermic and teratozoospermic groups, it has an aneuploidy frequency close to these two groups. These results reveal that sperm samples that are considered as normal in ART procedures need to be considered as sperm samples as teratospermia, asthenospermia and azoospermia.